摘要：结核分枝杆菌特殊的生理生化特性，使其能够通过多种方式逃逸宿主细胞的免疫杀伤，而长期存活在体内，导致结核病的预防和治疗面临着许多困难。因此，深入了解结核分枝杆菌的生理生化特性，可为揭示结核病的致病机制奠定基础。近一年来，国内学者通过生物学软件和蛋白的表达纯化技术等对结核分枝杆菌的多种抗原进行了生物学功能分析，此外，在生物膜、毒素-抗毒素系统以及类泛素-蛋白酶体系统等领域也进行了诸多研究。

关键词：结核分枝杆菌；抗原；生物膜；毒素-抗毒素系统；类泛素-蛋白酶体系统

结核分枝杆菌（ mycobacterium tuberculosis， M. tb）是结核病的主要致病菌，它是一种及其稳定的胞内寄生菌。 M. tb具有特殊的生理生化特性，如具有复杂的膜结构，由类似革兰阴性菌内膜的质膜、富含糖蛋白的周质区以及高度疏水的外膜构成，这让体内微环境中的 M. tb能够有效地隔离有害物质。此外， M. tb还能够分泌多种效应蛋白，这些蛋白可以促进 M. tb侵染入胞，具有抗氧化/氮化应激作用，参与细胞凋亡的调控，抑制吞噬体的成熟以及抑制细胞自噬等，最终介导 M. tb逃逸宿主细胞的免疫杀伤，在体内长期存活。因此，深入研究 M. tb的生理生化特性，可为揭示结核病的致病机制奠定坚实的基础。

M. tb的clpP2蛋白是clpP蛋白酶蛋白水解亚基单位2，在处于持留状态的细菌中维持表达，而在环境条件恢复正常后，可上调表达，提示可能成为指示 M. tb潜伏感染以及结核复燃的标记。刘思静等 ^[1]采用生物信息学软件对clpP2的结构、抗原表位及免疫学相关信息进行预测。结果表明clpP2蛋白由214个氨基酸组成，其中丙氨酸含量最多。蛋白相对分子质量2307.74，等电点为4.99。clpP2蛋白预测出6个B细胞线性表位、6个B细胞构象表位、5个CTL表位以及多个Th表位，且这些区域亲水性、表面可能性和柔韧性指数都较高，这些发现有助于深入研究clpP2蛋白的免疫功能，为结核诊断、治疗、预防的候选蛋白提供理论依据。

CarD（Rv3583c）是 M. tb的毒力蛋白，同时也是 M. tb调控rRNA转录的必需蛋白质，已有研究发现CarD蛋白抑制剂可抑制 M. tb的生长，从而降低结核病的发生。张德峰等 ^[2]运用生物信息学方法对CarD蛋白结构和功能进行分析，发现分枝杆菌CarD基因序列相似度为100%，进化关系较近。H ₃₇Rv与田鼠分枝杆菌起源于同一物种，同源性较高。此外，研究还发现CarD分子在进化过程中高度保守，为稳定、亲水性蛋白，无跨膜区、无信号肽，蛋白序列中存在4个丝氨酸磷酸化位点，5个苏氨酸磷酸化位点，1个酪氨酸磷酸化位点；CarD二级结构以α-螺旋为主。

PanD（Rv3601c）蛋白是合成分枝杆菌能量代谢所必需的辅酶A的关键分子，已有研究表明吡嗪酰胺抗性可能与 M. tb的 PanD基因突变有关。伊星昊等 ^[3]采用生物信息学的方法分析表明 PanD基因全长420bp，在 M. tb各菌株中普遍存在，且相似度100%，具有高度同源性，进化关系较近。PanD蛋白为稳定、疏水性蛋白、无跨膜区与信号肽，存在9个磷酸化位点。二级结构中以无规则卷曲为主，结构较疏松。此外，该蛋白具有多个潜在的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位，推测在 M. tb合成β-丙氨酸过程中具有重要作用，是治疗耐药结核的潜在新靶标。

AccD5是 M. tb中的乙酰辅酶A羧化酶，参与细胞壁或脂质的生物合成。车纾慧等 ^[4]采用生物信息学方法分析 AccD5蛋白，结果显示该蛋白共 548个氨基酸，分子式为C2621H4153N727O810S17，分子质量单位为59.3542×10 ³，理论等电点为5.19，脂溶性系数为91.15，不稳定性指数为31.21，亲水性平均系数为-0.16，预测该蛋白为稳定性亲水性蛋白；二级结构中α-螺旋、β-转角、β-折叠、无规则卷曲分别占37.23%、10.58%、22.81%和29.38%，预测的B细胞、CTL细胞抗原表位分别为14个和25个，为研发治疗结核新药提供了潜在靶标。

Rv2657c是在体外模拟 M. tb潜伏感染时，发现的一个与营养缺乏相关的抗原，位于BCG缺失区RD13。杨丹等 ^[5]通过生物学软件预测到Rv2657c蛋白有5个B细胞抗原表位，6个T细胞抗原表位。SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法及NetCTL法预测该蛋白有6个CTL表位；RANKPEP及SYFPEITHI超基序法预测该蛋白有38个Th表位，由此可见，Rv2657c蛋白既有B细胞表位也有T细胞表位，有可能成为结核病诊断抗原分子和候选疫苗抗原。

TB10.4属于 M. tb早期蛋白的ESAT-6家族，是 M. tb表现其毒力不可少的因子。任琪琪等 ^[6]成功构建TB10.4的原核重组表达体系并表达TB10.4，Western blot分析其免疫原性，证实TB10.4蛋白可被结核患者血清特异识别。此外，以重组TB10.4为抗原采用ELISA诊断结核病的灵敏度为88.5%，特异度为97.3%，阳性预测值93.8%，阴性预测值94.8%，诊断效率94.5%，表明TB10.4可用于结核病的免疫诊断。

研究发现分枝菌酸环丙烷合成酶（PcaA）和小分子热休克晶体蛋白（Acr）两个基因在 M. tb持留状态下高表达，可能参与 M. tb的持留感染，刘毅等 ^[7]为深入研究PcaA和Acr的功能作用，采用分子生物学方法成功构建了PcaA和Acr蛋白的克隆和表达载体，并获得表达和纯化的蛋白。通过ELISA方法检测结核病人、潜伏感染者和健康人血清中PcaA和Acr抗体水平，结果显示健康对照与活动性结核病（ATB）之间差异有统计学意义，而活动性结核病和潜伏感染（LTBI）之间差异并无统计学意义，因此PcaA和Acr蛋白不能用来鉴别LTBI和ATB，但可用于诊断是否感染结核分枝杆菌。

M. tb螺旋酶是由2个GyrA亚基和2个GyrB亚基组成的四聚体，GyrA和GyrB亚基只有结合在一起才具有催化活性。近年研究发现在喹喏哃类耐药 M. tb中不断观察到gyrB基因单独突变。为深入探讨GyrA和GyrB亚基的相互作用，寻找其相互作用的关键区域，王茂淋等 ^[8]构建了不同的GyrB亚基突变体，分析GyrB各突变体与GyrA亚基的相互作用对全酶活性的影响。研究发现GyrB亚基C端是其与GyrA相互作用的主要结构域，经分析GyrB的二维结构，发现GyrB中第531～550位氨基酸是一个α-螺旋结构，位于Toprim结构域二聚体界面的内侧，是Toprim结构域的重要支架结构，稳定和维持着Toprim的构型；由此提出该结构是影响螺旋酶功能的关键区域，并可能成为抗结核新药设计的靶标。

Rv3425属于RD区抗原，为深入研究其免疫原性，以及在结核病诊断和致病机制中的作用，王倩等 ^[9]成功将Rv3425基因克隆至pET28a载体中，诱导表达纯化后获得了可溶性原核表达融合蛋白Rv3425，该蛋白能刺激灭活结核分枝杆菌免疫小鼠脾细胞产生高水平的特异性IFN-γ。此外，纯化的Rv3425蛋白能与结核感染小鼠血清特异性结合，其特异性血清抗体IgG及IgM在结核病人中的水平明显高于健康人，同时发现该蛋白能诱导巨噬细胞的凋亡，这些发现对于结核病的诊断及致病机制的研究具有重要价值。

Rv0585c是结核分枝杆菌H37Rv和BCG共有的保守膜蛋白，王雪枝等 ^[10]对Rv0585c的人T细胞表位进行预测，发现共有66个人T细胞抗原表位，选取合成了9条表位分布集中的抗原表位多肽，并通过人群免疫学检测和动物免疫学试验对T细胞表位及其免疫原性进行分析，结果显示人群ELISpot试验筛选出3条阳性人T细胞表位多肽：P10110、P10112、P10117，用于肺结核检测的灵敏度分别为 14.00%、12.00%和 6.00%，特异度分别为100.00%、100.00%和97.96%；联合用于肺结核检测的灵敏度和特异度分别为22.00%和97.96%。动物免疫试验结果显示，P10110多肽高、低剂量刺激小鼠产生较高水平的IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10，P10112多肽高、低剂量刺激小鼠产生较高水平的IFN-γ、IL-2和IL-10，均高于阴性对照组，差异有统计学意义（ P＜0.001）。这些结果说明Rv0585c蛋白及其T细胞表位具有较好的免疫原性及免疫反应性，能刺激机体产生较强烈的细胞免疫应答，具有潜在的结核病细胞免疫诊断和新型结核疫苗的应用价值。

M. tb的PE/PPE家族由于能够参与MTB的生存，增殖，在致病力方面和宿主的相互作用中发挥重要的功能，一直是国内学者研究的重点。PE25蛋白由Rv2431c编码，PPE41蛋白由Rv2430c编码，二者有共同的操纵子。由Rv3872编码的PE35和由Rv3873编码的PPE68与PE25/PPE41蛋白复合体结构相似，为了筛选与PE25/PPE41和PE35/PPE68两对异源二聚体相互作用的宿主蛋白，李田田等 ^[11]构建诱饵重组质粒pcDNA-PE25-PPE41和pcDNA-PE35-PPE68，转染293T细胞后提取细胞总蛋白，采用串联亲和纯化结合质谱分析的方法筛选并鉴定与PE25/PPE41和PE35/PPE68相互作用的宿主蛋白，结果显示，PE25/PPE41鉴定到15个差异蛋白，PE35/PPE68，鉴定到29个差异蛋白，并分别挑选了与PE25/PPE41和PE35/PPE68相互作用的3个和7个差异蛋白，为进一步验证与PE25/PPE41和PE35/PPE68直接作用的宿主蛋白及研究其生物学功能奠定了基础。

细菌生物被膜是细菌吸附于生物材料或机体腔道表面，细菌分泌出多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等，并将细菌自身包裹其中形成的膜样物，是由多个细菌组成的一种膜状结构，是细菌为适应自然环境、有利于生存而特有的一种保护性生长模式，具有结构和代谢的复杂性。 M. tb为了抵抗环境的压力，在合适的条件下也可以形成生物膜。已有研究发现有生物膜的 M. tb及耻垢分枝杆菌，可承受超过50倍的最小抑菌浓度的抗结核药物异烟肼和利福平，说明生物膜在结核菌的抗药性中发挥了重要的作用。为了更好地研究结核菌生物膜的结构和作用，侯志丽等 ^[12]成功建立了 M. tb生物被膜的体外模型，结果显示36株非耐药 M. tb在孔板中培养时使用封口膜的全部培养出生物膜，而未使用封口膜的均培养失败。在烧瓶中培养 M. tb生物膜时，需要在培养3周时松开瓶盖，否则生物膜生长不良。同时，研究证实在培养2周时可看到有生物膜出现，5周时生物膜培养成熟，由此可见， M. tb在不同培养条件下，生物膜的形成情况明显不同。

M. tb的染色体上存在着毒素-抗毒素系统（toxin-antoxin systems，TAS），该系统可以感应外界不同的环境压力如营养缺乏、低氧、氧化应激、被巨噬细胞吞噬和抗生素毒性等，引起不稳定的抗毒素降解，毒素发挥作用，最终介导细菌生长抑制、耐药、持留状态或死亡的发生。刘微等 ^[13]运用实时定量PCR检测 M. tb单耐药株20株，耐多药株20株和标准株H37Rv毒素基因 mazF3，6，9及抗毒素基因mazE3，6，9的表达水平。结果表明，与对照株相比较，毒素基因 mazF6，9在单耐药组及耐多药组中的表达均高于标准株H37Rv，而 mazF3基因在标准株、单耐药组及耐多药组中的表达无差异。抗毒素基因 mazE3在单耐药及耐多药菌株中表达都低于标准株H37Rv， mazE9只在耐多药菌株低表达，而 mazE6的表达量与标准株H37Rv相比无统计学意义。

M. tb泛素样蛋白酶体系统（ubiquitin-like protein-proteasome system，PPS）由 M. tb泛素样蛋白（Pup）与 M. tb蛋白酶体组成。该系统介导的蛋白质降解过程中所需的辅助因子有Dop、PafA、Mpa。张帅等 ^[14]采用刃天青显色法，比较单耐异烟肼结核分枝杆菌（对照组）与4种基因（ Pup、 Dop、 PafA、 Mpa基因）分别过表达和缺失单耐异烟肼结核分枝杆菌菌株异烟肼最低抑菌浓度（MIC）值的差异。结果表明与单耐异烟肼结核分枝杆菌相比，异烟肼的MIC值过表达 PafA基因株增加1.03μg/ml，过表达 Dop、 Mpa基因株分别降低 1.03μg/ml、0.68μg/ml，差异均无统计学意义（ P＞0.05）；过表达 Pup基因株异烟肼的MIC值增加8μg/ml，差异有统计学意义（ P＜0.05）；缺失 Pup、 Dop、 PafA、 Mpa基因株异烟肼的MIC值分别降低4.82、4.98、4.99、4.9μg/ml，差异均有统计学意义（ P＜0.05）。此外研究人员加入改变细胞壁通透性试剂后，与单耐异烟肼结核分枝杆菌相比，过表达 Pup基因株的MIC值增加7.78μg/ml，差异有统计学意义（ P＜0.05）；缺失 Pup、 Dop、 PafA、 Mpa基因株分别降低4.58、4.73、4.75、4.68μg/ml，差异均有统计学意义（ P＜0.05）；过表达 Dop、 Mpa基因株分别降低1μg/ml和0.7μg/ml，过表达 PafA基因株增加0.97μg/ml，差异均无统计学意义（ P＞0.05）。由此推测 M. tb的PPS可能通过调控单耐异烟肼 M. tb细胞壁的通透性影响其耐药性。

此外，该研究团队采用同样的方法探讨了PPS对 M. tb单纯利福平耐药性是否有影响。结果显示 Pup、 Dop、 PafA、 Mpa基因的过表达均能增强单纯耐利福平 M. tb对利福平的耐药性，而 Pup、 Dop、 PafA、 Mpa基因的缺失均能显著降低单纯耐利福平 M. tb对利福平的耐药性。加入羰基氰氯苯腙、利血平、维拉帕米和氯丙嗪4种外排泵抑制剂能不同程度的降低各过表达菌株对利福平的MIC，并且，PPS与外排泵抑制剂之间存在一定交互作用，由此推测PPS可能通过调控外排相关通路蛋白来影响 M. tb单纯利福平耐药性的产生 ^[15]。

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