摘要：我国是全球结核病第二大高负担国家，约1/3的人口感染结核菌，每年新发结核病100万左右，其中约12万是耐多药结核病。敏感结核病与耐多药结核病流行情况的研究不断更新人们对结核病传播规律的认识。随着培养的推广与分型技术的发展，非结核分枝杆菌的流行也逐渐获得更多的关注。临床快速检测仍然是研究的热点，新型技术的开发、成熟技术的评估及潜在标志物的鉴定均有一定进展。

关键词：结核病；基因分型；耐药菌株；耐药基因；非结核分枝杆菌

数目可变串联重复序列分型（mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number of tandem repeat，MIRU-VNTR）技术是国内应用较广泛的结核分枝杆菌分型技术，用于鉴定相同基因型菌株的传播事件，但是目前没有统一的标准位点，各地区可根据当地流行菌株情况进行位点的选择。孙荣等 ^[1]收集贵州某医院2014年共185株临床菌株（耐多药菌株57株、全敏感菌株97株）进行12位点MIRU-VNTR分型，经聚类分析可分为5个大群，性别、年龄间的分布差异无统计学意义，且各群的耐多药率分别为31.3%、25.0%、18.8%、0.0%与25.0%，差异无统计学意义。各分型位点中MIRU26和MIRU31呈高等程度多态性，分辨指数HGDI值从0到0.822不等。共将50株菌株（27.0%）分到16个簇，各簇包含2～10株菌。

无论选择哪一套分型位点，耐多药结核病的成簇率常高于敏感结核病。如李同心等 ^[2]在重庆市两家综合医院2013—2015年临床诊断的753例耐多药结核病患者中，选择MGIT 960培养阳性的538例（71.4%），经PCR鉴定，排除34株（6.3%）牛结核分枝杆菌与35例（6.5%）非结核分枝杆菌，剩余469例（87.2%）结核分枝杆菌中，北京型占93.0%（436/469），非北京型占7.0%（33/469）。利用12位点MIRU-VNTR对503株结核分枝杆菌复合群进行分型，其中236株（46.9%，236/503）可归入81个簇，各簇包含2～24株菌株。危险因素分析显示≤30岁人群感染北京型耐多药菌株概率升高。

挑选分辨力较高的位点进行分型，成簇率会有一定下降。段琼红等 ^[3]从国际标准15位点中挑选11个位点，及国内多项研究报道的4个高分辨力位点（ETR-B、MIRU23、MIRU27、MIRU39），对武汉市2015—2016年105例耐多药结核病患者中分离到的98株临床菌株进行基因分型，其中33株菌（33.7%）构成7个簇，1簇的耐药表型完全相同，其他簇最少包含1株不同耐药表型的病例。该套位点累积HGDI值为0.9708，其中Mtub21与MIRU26分辨指数最高，分别为0.7450和0.6813。

来源于医院的样本由于抽样偏倚，难以代表该地区内人群中疾病的流行水平。而耐多药结核患者的治疗常集中于若干定点医院，可减少这种偏倚，其成簇率更接近真实的传播水平。同时结核病发病缓慢，结核菌成簇率受采样时间的影响，一年时间的样本成簇率较低，至少采集同一地区连续三年的菌株才能反映其近期传播水平。另外，国内尚需要统一与标准化VNTR分型位点，以便各地区之间的相互观测与比较。

非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）是除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌之外的一群分枝杆菌，目前已发现170多种。近年来由NTM引起的疾病疫情逐渐升高，且各地域流行情况不一，优势菌种各有差异。

北京市2009年与2013年的NTM分离率分别为3.8%（59/1552）和4.6%（71/1553），以胞内分枝杆菌（ M. intracelulare）与堪萨斯分枝杆菌（ M. kansassi）为主，分别占39.2%（51/130）与37.7%（49/130） ^[4]。各种NTM对常用的抗结核药物均具有较高的耐药性，一线药物耐药率依次为异烟肼98.0%（95/97）、链霉素94.8%（92/97），利福平54.6%（53/97）及乙胺丁醇50.5%（49/97）。临床上需及时鉴别并进行药敏试验，根据药敏结果指导用药。

甘肃省2012—2014年MGIT 960培养阳性菌株中，4.9%（43/875）被鉴定为NTM，其中胞内分枝杆菌（ M. intracelulare）最多，占72%（31/43） ^[5]。

福建省2005—2011年初步鉴定为NTM的450株菌株利用不同方法确定菌种，重复PNB/TCH法检测出41株结核分枝杆菌，多位点PCR鉴定出45株结核分枝杆菌，其余405株NTM同时经检测 hsp65与 rpo B以确认菌种，其中284株（70.1%）菌株检测结果一致，不一致的菌株经测序进一步鉴定，共鉴定出23种NTM及1株戈登菌 ^[6]。NTM主要包括胞内分枝杆菌（ M. intracelulare）42.7%（173/405）、鸟分枝杆菌（ M. avium）21.7%（88/405）与脓肿分枝杆菌（ M. abscessus）13.6%（55/405）。

结核分枝杆菌及其耐药性的快速鉴定是结核病确诊与有效治疗的关键。Xpert MTB/RIF作为WHO推荐的快速分子检测方法，在国内逐渐推广。纪丽微等 ^[7]利用Xpert MTB/RIF检测MTB标准株（H37Rv、H37Ra和牛分枝杆菌）、20种常见NTM参考株与20株NTM临床株及18种非分枝杆菌病原体，MTB的检测敏感度为1×10 ² CFU/ml，并且利用三种不同前处理方法对100株MTB临床株进行检测与比较，其中“改良直接法”的报错率最小，“沉渣法”与“直接法”的报错率增加且有统计学意义（ P＜0.05， P＜0.01），建议优化痰标本前处理过程，于SR痰标本处理液中加0.5%的半胱氨酸后按照标准操作进行，以提高Xpert检测效果。

传统药敏操作过程中，也可通过步骤优化提高检测效果。江渊等 ^[8]收集上海市2015年726株MTB临床菌株，利用细菌超声分散计数仪与手工磨菌法进行分散、比浊，对比两种方法处理后，药物敏感性试验中低浓度药敏下菌落生长的可读性，差异有统计学差异。细菌超声分散计数有利于试验结果的判读，且能够提高试验的自动化程度。

基因芯片技术可快速检测标本中的分枝杆菌耐利福平基因 rpo B及耐异烟肼 kat G、 inh A基因中的常见突变位点，是快速检测结核菌耐药性方法之一，具有高通量、高特异性的特点。许榕青等 ^[9]对其效果进行评价，收集福州市某医院2014—2015年涂阳肺结核痰标本进行培养，1108份阳性标本中，基因芯片鉴定出100株NTM，菌株分型与PNB鉴定的符合率为99.1%，利福平与异烟肼耐药鉴定与MGIT液体培养的符合率分别为98.1%与94.5%，与DNA测序法相比符合率分别为99.6%和99.8%。

除此之外，新耐药机制的研究及耐药标识的发现可以为未来耐药发展规律与鉴定提供新的思路与方法。与标准株对比，刘微等 ^[10]对单耐药、耐多药各20株结核临床菌株利用qRT-PCR检测毒素基因 maz F3/6/9与抗毒素基因及 maz E3/6/9，结果显示耐药菌的 maz F6/9表达均升高且有统计学差异、mazE3降低有统计学差异， maz E9在单耐药菌中表达无变化，在耐多药菌株中显著降低，且高表达的耐药株在低营养、低氧条件下适应力增加，提示这些基因可能参与耐药形成，具体机制尚需进一步研究验证。

1.孙荣，毕雅坤，欧维正，等.贵州省结核分枝杆菌临床分离株MIRU-VNTR位点基因分型研究.中国病原生物学杂志，2017，12（1）：29-33.

2.李同心，黄正谷，王易伟，等.重庆地区耐多药结核分枝杆菌基因分型特征分析.第三军医大学学报，2017，39（12）：1298-1303.

3.段琼红，陈聪，王坚杰，等.武汉市耐多药结核分枝杆菌的MIRU-VNTR分子特征.中华疾病控制杂志，2017，21（1）：26-29.

4.张洁，苏建荣，丁北川，等.北京地区非结核分枝杆菌菌种分布及耐药性研究.中华结核和呼吸杂志，2017，40（3）：210-214.

5.张鑫，蔡静，姜元，等.43株甘肃临床分离非结核分枝杆菌分类鉴定.中国人兽共患病学报，2017，33（2）：173-177.

6.刘海灿，黄明翔，蒋毅，等.福建省肺非结核分枝杆菌临床分离株的菌种鉴定.中国人兽共患病学报，2017，33（5）：389-397.

7.纪丽微，林健雄，彭东东，等.Xpert MTB/RIF检测痰标本中结核分枝杆菌的法学研究.中国病原生物学杂志，2017，12（6）：549-552.

8.江渊，李静，张阳奕，等.细菌超声分散计数仪在结核分枝杆菌药物敏感性试验中的应用价值.中华结核和呼吸杂志，2017，40（4）：289-293.

9.许榕青，李丹，林银霞，等.基因芯片技术检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性临床应用评价.中国人兽共患病学报，2017，33（1）：43-48.

10.刘微，赵继利，屈艳琳，等.qRT-PCR检测结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统mazEF的表达.中国人兽共患病学报，2017，33（2）：143-147.