第一节 细胞培养概述

一、细胞培养的基本概念

1．体外培养（In vitroculture）

是指将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，即模拟体内环境，使其生长和发育的方法。

2．细胞培养（Cell culture）

是指将活细胞尤其是分散的细胞在体外进行培养的方法。

3．组织培养（Tissue culture）

是在人为创造的无菌条件下，从生物体内取出活的组织或组织块置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续体外培养以获得组织或个体。

4．器官培养（Organ culture）

是将活体的一部分进行分离培养，是广义的组织培养形式之一。将部分或整体器官在不损伤正常组织结构的条件下进行体外培养，仍保持组织的三维结构，并能模仿在各种状态下的器官功能。

二、细胞培养方式

细胞培养方式大致可分为群体培养和克隆培养两种。群体培养（Mass culture）是将含有一定数量细胞的悬液置于含有特定培养液的培养瓶中，使细胞贴壁生长，每个细胞距离较近，汇合后形成均匀的单细胞层；克隆培养（Clonal culture）是将高度稀释的游离细胞悬液置于含有特定培养液的培养瓶中，各个细胞贴壁生长后，彼此距离较远，经过生长增殖，每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（Clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。此外，为了制取细胞产品而设计了旋转培养法，使用大容量的圆培养瓶，在培养过程中不断地转动，使培养的细胞始终处于悬浮状态中而不贴壁。

正常细胞培养的世代数有限，只有肿瘤细胞或发生转化的细胞才能无限生长。所谓转化是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。

1．原代培养

原代培养（Primary culture）是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。原代培养的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要更换细胞培养基。将细胞从培养器中取出，把一部分移至新的培养器中再进行培养。

2．细胞株

细胞株（Cell strain）是指通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的细胞群，即细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株能够繁殖50代左右，其特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。

3．细胞系

原代培养物经首次传代成功后即为细胞系（Cell line），因此细胞系可泛指一般可能传代的细胞，即从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖。其中不能继续传代，或传代次数有限的细胞系称为有限细胞系（Finite cell line）；可以连续培养的细胞系则称为无限细胞系（Continuous cell line），可培养50代以上并无限培养下去。常见的细胞系有人宫颈癌上皮细胞（HeLa）、人肝母细胞瘤（HepG2）、人肺癌上皮细胞（A549）、人乳腺癌上皮细胞（MCF7）、卵巢细胞（CHO）、大鼠嗜铬细胞（PC12）等。

4．克隆

克隆即无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。

三、体内、外细胞的差异与分化

1．体内、外细胞的差异

因为细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，细胞长时间离体，所以易发生变化，包括：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。

2．体内、外细胞的分化

体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化，关键在于是否存在使细胞分化的条件，如小鼠红白血病细胞在一定的因素作用下可以合成血红蛋白；血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构；杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体等，这些变化均属于细胞分化行为。

四、细胞培养的一般过程

细胞培养的一般过程包括准备工作、取材、细胞培养、细胞冻存及细胞复苏等。

（一）准备工作

准备工作对开展细胞培养非常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括：器皿的清洗、干燥与消毒，细胞培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试等。

（二）取材

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞，经过一定的处理，如消化分散细胞、分离等后接种在一定的培养器皿中，这一过程称为取材。如果是细胞株的扩增培养则无取材这一过程。从理论上讲，各种动物和人体内的所有组织均可以用于体外培养。实验表明，幼体组织尤其是胚胎组织比成年个体的组织容易培养；分化程度低的组织比分化程度高的组织容易培养；肿瘤组织比正常组织容易培养。

取材时应注意以下几点：①取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质；②取病理组织、皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可事先用抗菌素处理；③取材后应立即处理，尽快培养。如果不能立即培养，可将组织块切成黄豆般大小的组织小块，然后将组织小块放在培养液中，置于冰箱中于4℃下保存。

（三）细胞培养

将取得的组织细胞接种在培养瓶或培养板中的过程称为培养。如果所要培养的对象是组织块，可直接把组织块接种在培养器皿底部，几个小时后组织块就可贴牢在培养器皿底部，再加入细胞培养基。如果所要培养的对象是细胞，一般应在接种前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接种在培养器皿中并直接加入一定量的细胞培养基（细胞计数的具体操作方法见本章第四节）。

细胞培养时应注意以下两点：①细胞接种在培养器皿中后，应立即放入二氧化碳培养箱中，使细胞尽早进入生长状态；②正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括：细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染；细胞培养基的pH值是否过酸或过碱，常用酚红指示剂指示细胞培养基的pH值；定时检查培养温度；定时检查培养箱中CO2浓度等。

一般原代培养在培养初期细胞有一段潜伏期，潜伏期为数小时到数十天，细胞在潜伏期时一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶中继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞，即指数生长期细胞是进行各种医学研究的良好材料。

（四）细胞冻存

为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存时一般用液氮，冻存温度为－196℃。将细胞收集至冻存管中，加入含保护剂的细胞培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的（具体操作方法见本章第四节）。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等均对细胞活力有影响。目前，冻存细胞常用的保护剂为二甲亚砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）或甘油。

（五）细胞复苏

复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在1min内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养（具体操作方法见本章第四节）。

五、主要仪器设备及消耗品

（一）设施

细胞培养常用的设施包括：无菌室、超净工作台、电热恒温培养箱（CO2培养箱）、倒置显微镜、液氮储存罐、电热鼓风干燥箱、低温冰箱、电子天平、恒温水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器、自动三重纯水蒸馏器、纯水仪、无菌过滤器、抽气泵、酸缸、细胞计数板、微量加样枪和电子细胞计数仪等。

1．超净工作台

超净工作台（Clean bench）通过风机将空气吸入预过滤器，经由静压箱进入高效过滤器过滤，将过滤后的空气以垂直或水平气流的状态送出，可以排除工作区原来的空气，将尘埃颗粒和生物颗粒带走，以形成无菌的、高洁净的工作环境。超净工作台根据气流的方向分为垂直流超净工作台（Vertical flow clean bench）和水平流超净工作台（Horizontal flow clean bench）；根据操作结构分为单边操作及双边操作两种形式；按其用途又可分为普通超净工作台和生物超净工作台。需注意超净工作台与生物安全柜（Biosafety cabinet）不同。超净工作台只能保护在工作台内操作的试剂等不受污染，并不保护工作人员，而生物安全柜是负压系统，能有效保护工作人员。

2．CO2培养箱

CO2培养箱是进行细胞、组织或细菌培养必需的关键设备，CO2培养箱是在普通培养的基础上加以改进的，主要是能加入CO2，以满足培养细胞、组织或细菌所需的环境。CO2培养箱是通过CO2浓度传感器来控制CO2的浓度。CO2培养箱通常设定的条件为37℃, 5%CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意以下几点：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气；②保持培养箱内空气干净，定期消毒；③箱内放置灭菌蒸馏水，保持箱内湿度，避免培养液蒸发。

（二）塑料器材

细胞培养所需的塑料器材包括：细胞培养板、细胞培养瓶、细胞培养皿、带刻度吸管、不带刻度吸管、各种规格离心管、冻存管、0.22μm滤器、各种规格的枪头等。

1．细胞培养板

细胞培养板是细胞培养实验中常用和重要的耗材。细胞培养板依据底部形状的不同可分为平底（U形）和圆底（V形）；根据材质的不同有Terasaki板和普通细胞培养板；常用的细胞培养板规格有96孔板、48孔板、24孔板、12孔板和6孔板等。不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般为2~3mm，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液量过多，会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。不同的实验需要细胞培养板的规格、形状各不相同，具体选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定。各种规格的细胞培养板所接种的细胞密度，即细胞接种量（个/mL）可参考表1-1，在实验中也可依据具体实验的目的不同灵活掌握。

2．细胞培养瓶

常用细胞培养瓶的规格有12.5cm2、25cm2、35cm2、75cm2和150cm2等，每种培养瓶在接种细胞时的细胞接种量不同，各种规格培养瓶所接种的细胞密度（个/mL）可参考表1-2，在实验中也可依据具体实验的目的不同灵活掌握。

3．细胞培养皿

常用细胞培养皿的规格有35mm、60mm、100mm、150mm等，每种培养皿在接种细胞时的细胞接种量不同，各种规格培养皿所接种的细胞密度（个/mL）可参考表1-3，在实验中也可依据具体实验的目的不同灵活掌握。

（三）橡胶器材

橡胶制品最好是硅制品，用来做各种瓶或试管的塞子、盖子。

（四）金属器材

剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科剪刀、眼科镊等手术器械。

（五）其他物品

牛皮纸、硫酸纸、铝箔纸、棉布、铝饭盒、纱布、棉花、滤纸、各种规格的试剂瓶、注射器和针头等。

六、细胞培养的无菌环境

（一）无菌室

1．无菌室的结构

无菌室一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。

2．无菌室的消毒和防污染

为保持无菌室的无菌状态，需要对无菌室经常进行消毒处理。通常采用以下方式对无菌室进行消毒：使用前采用紫外照射1~2h；每周再用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸2h；每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁1次。但在实际工作中要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。

此外，还应注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，使外界空气直接对流进入无菌室的操作间等。

（二）超净工作台

工作原理：鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被慢慢吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。根据气流在超净工作台的流动方向不同，可将超净工作台分为侧流式、直流式和外流式三种类型。

超净工作台的使用与保养：超净工作台的平均风速保持在0.32~0.48 m/s为宜，过大、过小均不利于保持净化度；使用前最好开启超净工作台内紫外灯照射10~30min，然后让超净工作台预工作10~15min，以除去臭氧和使超净工作台的工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%酒精将超净工作台的台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净工作台。

七、常用培养器皿的清洗消毒

细胞培养需要大量的消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等。因此，掌握细胞培养常用器皿的清洗、消毒和灭菌知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必需的。

（一）清洗

在离体条件下，有害物质可直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生明显的毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须严格进行清洗处理，达到不含任何残留物的要求。

1．玻璃器皿的清洗

玻璃器皿的洗涤一般分为浸泡、刷洗、烘干、浸酸和冲洗5个步骤。

（1）浸泡：新的或使用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前要先用自来水简单刷洗，然后用5%盐酸浸泡过夜；使用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故应立即浸入清水中备刷洗。

（2）刷洗：将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、烘干或晾干，备浸酸。

（3）烘干：将刷洗干净的玻璃器皿洗净后，放入电热鼓风干燥箱中50~60℃烘干。

（4）浸酸：是将上述器皿浸泡到清洁液（酸液）中，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸时间一般不应少于6h，过夜或更长时间效果更好。另外，在放取器皿时一定要小心，注意安全。

（5）冲洗：刷洗和浸酸后的器皿必须用水充分冲洗，浸酸后器皿冲洗得是否干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水—倒空”15次以上，最后用双蒸水浸洗2~3次，晾干或烘干后包装备用。

2．橡胶制品清洗

新的橡胶制品洗涤方法：先用0.5mol/L的NaOH溶液煮沸15min，再用流水冲洗；接着用0.5mol/L的盐酸煮沸15min，再用流水冲洗；用自来水煮沸2次，每次15min；最后用蒸馏水煮沸20min，然后将橡胶制品放入电热鼓风干燥箱中50℃烤干备用。

3．塑料制品的清洗

塑料制品的特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强，但不耐热。清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水中过夜，用纱布或棉签蘸50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液中15min，流水冲洗15~20次，蒸馏水浸洗3次，双蒸水中泡24h，晾干备用。

4．包装

对细胞培养用品进行消毒前，需要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料有牛皮纸、硫酸纸、铝箔纸、棉布、铝饭盒等。用铝箔包装，非常方便，适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入铝饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。

（二）消毒和灭菌

微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因，常用的消毒和灭菌方法包括物理消毒法、化学消毒法和抗生素消毒法等。

1．物理消毒法

常用的物理消毒法有紫外线消毒、高温湿热灭菌、高温干热消毒、过滤除菌等。

（1）紫外线消毒：紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。其中，革兰氏阴性菌最为敏感，其次是革兰氏阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。目前多用紫外线直接照射细胞培养室消毒，用法简单，效果好。

紫外灯的消毒效果与紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯与被照物距离增加而降低，照射剂量与照射时间呈正比。因此，紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2m的30 W灯可照射9m2房间，每天照射2~3h，期间可间隔30min。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5m，照射时间以30min为宜。因为紫外灯不仅对皮肤、眼睛有伤害，且对培养细胞与试剂等也会产生不良影响，所以在进行细胞培养时不要开着紫外灯操作。

（2）高温湿热灭菌：压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。高温湿热灭菌方法对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、玻璃器皿、金属器皿、橡胶和某些培养液都可以用此方法灭菌。不同压力，蒸汽所达到的温度不同；消毒物品不同，所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60~70℃烤箱内烘干，再储存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。

（3）高温干热消毒：干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上，并保持90~120min，杀死细菌和芽孢，以达到灭菌的目的。主要用于灭菌玻璃器皿，如体积较大的烧杯、培养瓶等；金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品，如粉剂、油剂等。干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后再打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。烧灼也是灭菌方法之一，进行细胞培养时常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。

（4）过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用0.22μm的微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。

2．化学消毒法

新洁尔灭（苯扎溴铵）的0.1%水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。除了用新洁尔灭消毒以外，还可用70%酒精消毒。

3．抗生素消毒法

抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的急救方法。抗生素不同，杀灭微生物不同，应根据需要选择具体的抗生素。

可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。如常用过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁尔灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液等。