第二节 氧化应激检测指标

ROS自由基可引起细胞生物大分子，如脂质、DNA以及蛋白质的氧化损伤，对细胞造成氧化损伤。通过脂质过氧化使膜磷脂发生改变是氧化损伤主要攻击的靶标。ROS自由基也能促使DNA及核酸的化学修饰及结构的改变，包括碱基修饰，甚至能够引起DNA链的断裂。因此脂质过氧化产物MDA的检测和DNA损伤的检测已成为氧化损伤的重要生物学标志物。另外，活性氧过多产生还可以引起蛋白质氧化损伤，导致蛋白羰基的产生，所以，蛋白羰基含量的测定是检测氧化损伤的另一个重要的生物标志物。因此，检测组织或细胞内脂质过氧化产物、DNA损伤程度和蛋白氧化损伤产物及抗氧化物含量、抗氧化酶活性等是评价氧化应激最常用的指标。

ROS自由基损伤机体的生物分子后可产生大量特异性的氧化代谢产物，这是氧化应激作用于机体的结果，测量这些代谢产物可准确反映机体的氧化应激状态，但单独用某一种指标难免片面，应综合考虑各种氧化代谢产物。

一、丙二醛

ROS自由基攻击生物膜上的多不饱和脂肪酸，启动脂质过氧化链式反应，最终形成各种毒性产物，如毒性醛类——丙二醛（MDA）、4－HNE和丙烯醛等。它们对某些氨基酸残基具有修饰作用，可与蛋白质形成醛－蛋白加合物，引起蛋白质的变性，还可引起DNA的损伤。它们不仅是氧化应激的产物，还可介导氧化应激的发生，进而引起细胞毒性。

其中MDA是细胞膜发生脂质过氧化反应的主要终末产物，是目前反映机体氧化损伤最具代表性的指标之一，其在细胞中的含量高低可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映机体细胞受ROS自由基攻击产生氧化损伤的严重程度。常用TBA比色法检测组织或细胞中MDA含量。

二、谷胱甘肽

谷胱甘肽（GSH）属于巯基还原缓冲体系。巯基是体内主要的非酶性抗氧化剂，包括蛋白巯基和非蛋白巯基。GSH是需氧生物中主要的非蛋白巯基，通过直接作用和参与某些抗氧化酶的酶促反应，协调内源性与外源性抗氧化剂的作用，维持自由基的产生和清除，保护细胞免受ROS自由基的氧化损伤，并使内环境处于稳定的还原态。GSH可在非酶反应中与·OH－等ROS自由基直接反应从而将其清除；在GSH-Px的酶促反应中，GSH被氧化为GSSG，在谷胱甘肽还原酶的作用下重新转变为GSH，发挥抗氧化作用；GSH还可直接或通过谷胱甘肽转硫酶（GST）的催化作用与亲电子化合物结合，使各种亲电子化合物，如脂质过氧化代谢产物等通过与GSH结合而解毒。

GSH是一种低分子清除剂，是细胞内主要的抗氧化物，其量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素，可间接反映细胞的抗氧化能力。因此，检测细胞内GSH含量，可反映机体的抗氧化能力及细胞的氧化应激状态。

三、超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（SOD）属于酶抗氧化系统。广泛分布于各种生物体内，如动物、植物、微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD是抗氧化体系中较为关键的酶，主要存在于细胞浆内，作为一种ROS自由基的清除剂，可以把歧化成H2O2和O2，从而保护细胞不受毒性氧自由基的损伤；其还可以清除其他自由基，能够使机体内的超氧阴离子自由基维持在正常水平，测定其活力可反映组织或细胞内自由基清除的情况。由于SOD在抗氧化系统中有着非常重要的作用，因此，检测SOD的活性可间接反映机体的抗氧化能力。

四、谷胱甘肽过氧化物酶

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）属于酶抗氧化系统。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化物分解的酶，它能特异性催化谷胱甘肽对过氧化物的还原反应，把过氧化物转化为水或相应的醇类，能消除有害的过氧化代谢产物，阻断脂质过氧化链反应。GSH-Px利用GSH作为底物，还原H2O2和氢过氧化物。GSH-Px还可在CAT含量少或H2O2产量很低的组织中代替CAT清除H2O2。

GSH-Px在抗氧化系统中有着非常重要的作用，因此，检测GSH-Px的活性可间接反映机体的抗氧化能力。

五、过氧化氢酶

过氧化氢酶（CAT）也属于酶抗氧化系统。CAT是一种普遍存在的抗氧化酶，其功能是催化过氧化氢（H2O2）的分解，生成水和氧气。过氧化氢在真核细胞内以多种氧化酶和超氧化歧化酶的副产物形式存在。过氧化氢在细胞内的聚集会引发细胞内DNA、蛋白质和脂质的氧化，从而导致基因突变和细胞死亡。

CAT在抗氧化系统中有着非常重要的作用，因此，检测CAT的活性可间接反映机体的抗氧化能力。

六、蛋白质羰基化

蛋白质广泛存在于细胞内外，极易受ROS自由基和RNS自由基攻击而使蛋白质的氨基酸发生氧化和硝化修饰。目前对于蛋白质氧化损伤的检测指标主要有两个，分别是蛋白羰基生成（羰基化）和硝基酪氨酸的生成（蛋白质中酪氨酸硝基化）。

蛋白质羰基化是蛋白氧化产物，蛋白质的羰基化水平是评价蛋白质总的氧化程度的常用方法。蛋白质羰基化是蛋白质的非酶促的不可逆羰基修饰，主要包括：①蛋白质与不同来源的ROS自由基反应，生成蛋白质羰基加合物；②蛋白质本身氧化生成蛋白质羰基衍生物。由于羰基的生成具有普遍性，因此被广泛用作检测蛋白质氧化损伤的指标。

七、8－羟化脱氧鸟嘌呤

ROS自由基可以直接攻击生物大分子DNA诱发DNA氧化损伤。在各种氧化损伤中，以鸟嘌呤8位碳原子氧化后形成8－羟基脱氧鸟嘌呤（8-OHdG）最为常见。8-OHdG是敏感的DNA损害标志物，引起DNA氧化损伤的ROS自由基主要是·OH－。尿中8-OHdG是全身DNA受氧化损伤后经切除修复而排出的量，可反映对氧化损伤的修复程度，因而8-OHdG被认为是内源性氧自由基引起DNA氧化损伤的一种标志。

由于8-OHdG是DNA氧化损伤的标志性产物，因此，可通过测量8-OHdG的含量来评估DNA氧化损伤的严重程度。

八、DNA损伤

ROS自由基可以直接攻击生物大分子DNA诱发DNA氧化损伤。ROS自由基也可以导致不同形式的DNA损伤，包括碱基断裂、碱基突变及DNA双链断裂。DNA双链断裂是细胞内多种类型的DNA损伤中最危险、最严重的一种。DNA损伤是评价细胞氧化损伤的重要指标之一，检测DNA损伤的技术很多，单细胞凝胶电泳技术（彗星试验）是检测DNA单链断裂的常用方法。单细胞凝胶电泳技术是一种建立在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的常用技术方法，因其具有操作简便、快速、灵敏度高等特点而被广泛应用。彗星试验时，若DNA链未受损伤，则基因组DNA始终停留在核基质中，经溴化乙啶（Ethidium bromide, EB）或碘化丙啶（Propidium iodide, PI）染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。当DNA链受损后，片段的缺口暴露了负电荷，在电场力的作用下离开DNA核，在凝胶电泳中向阳极移动，形成拖尾，呈彗星状。细胞核DNA受损伤越严重，细胞DNA的断链和碱变性片断越多，断链越小，在相同电泳条件下，发生迁移的DNA量就越多，迁移的距离也越长。DNA损伤程度越严重，导致DNA结构变化，当DNA结构损伤加重时，导致基因突变、染色体畸变、恶性转化或细胞凋亡。因此，尾长（Tail length）、尾部DNA百分含量（Tail DNA%）及尾矩（Tail moment）是该实验中3个常用的检测指标，三者结合可以更全面地反映DNA的损伤程度。因此，也可利用单细胞凝胶电泳技术（或称彗星试验）检测细胞中氧化损伤引起DNA断裂来评价氧化应激状态。

九、活性氧

活性氧（ROS）是细胞内主要的氧化剂。ROS是需氧细胞在代谢过程中产生的一类含氧、化学性质活泼、氧化性强的活性氧簇。生物体内产生的ROS主要有超氧阴离子、羟自由基（·OH－）及其活性衍生物如过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）、LO·、LOO·和LOOH等脂质过氧化物。DCFH-DA常用于表征细胞内ROS的总量，以此指示细胞内的氧化应激程度。在对细胞内ROS的检测中，由于ROS的物质化学反应活性强，存在寿命短，其检测极为困难，迄今尚无特别专一有效的方法，DCFH-DA荧光探针法是目前国内外检测细胞内ROS水平常用的方法，常用此法来定量检测细胞内ROS水平的变化。

因为ROS是细胞内主要的氧自由基，所以可通过荧光探针DCFH-DA标记法检测组织或细胞内ROS的水平，反映细胞内氧化系统的情况。

十、线粒体膜电位

线粒体在细胞代谢和向机体提供能量过程中扮演着重要的角色。线粒体是多种外源化合物细胞毒性的主要靶点，特别是氧化损伤的主要靶细胞器。线粒体即是细胞产生ROS的主要场所，也是多数有毒化合物攻击的主要靶点。ROS过多生成可损伤线粒体膜，导致线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential, MMP）即线粒体ΔΨm降低。近年来，线粒体在细胞凋亡机制研究中的作用越来越受到关注。研究表明，在细胞凋亡发生时，线粒体的结构和功能会发生明显变化，表现为线粒体膜通透性增高及线粒体ΔΨm降低。

细胞线粒体ΔΨm是由于线粒体内膜两侧质子及其他离子不对称分布造成的，它是线粒体基质环境稳定的指标，也是维持线粒体正常生理功能的重要保证。线粒体ΔΨm是反映线粒体功能的早期敏感指标，应用荧光探针罗丹明123标记法观察可敏感地检测到线粒体膜电位变化，是一种检测线粒体功能变化的理想手段。

因为线粒体ΔΨm是反映线粒体功能的关键指标，线粒体ΔΨm降低，表明细胞发生线粒体损伤，所以可通过荧光探针罗丹明123标记法检测细胞线粒体膜电位，来反映细胞线粒体损伤情况。

十一、三磷酸腺苷

线粒体是真核胞质中含有核外遗传物质的细胞器，为细胞提供直接利用的能量三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）。因此，线粒体在细胞代谢和向机体提供能量过程中扮演着重要的角色，线粒体在能量吸收和转换过程中，如受到外界环境的影响，将会产生线粒体应激损伤。若线粒体内自由基持续增多，就会使PTP打开，耗氧量减少，ATP合成降低，这样不仅会使线粒体膜电位耗竭，也会释放Ca2+、细胞色素C、Caspas以及膜间隙中的其他凋亡因子，导致细胞凋亡。

ATP作为细胞能量的直接提供者，由线粒体合成。ATP水平可直接反应线粒体的功能状态，也提示线粒体是否损伤以及损伤程度。荧光素酶发光法常用来检测细胞内ATP水平。因此，可通过荧光素酶发光法检测细胞内ATP水平，来反映线粒体损伤的程度。