第二节　中药药理学实验的基本技能

一、实验动物标记

在中药药理学动物实验中，为了观察每只实验动物的变化情况，必须在实验前对实验动物进行随机分组、编号标记，以进行个体识别。良好的编号标记方法要保证标记符号清晰持久、简便易认。应使用对动物无毒性，操作简单且长时间能够识别的方法。

1.染色法：是实验室最常用、最容易掌握的方法。可用化学药剂或油性记号笔在动物身体明显部位如被毛、尾部等处进行涂染标记，标记时用棉签蘸取染色剂，在动物体的不同部位涂上斑点，以示不同号码。编号方法无统一规定，一般常用编号的原则是：先左后右，从前到后。例：一般把涂在左前肢上的记为1号，左腰部为2号，左后肢为3号，头顶部为4号，背部为5号，尾部为6号，右前肢为7号，右腰部为8号，右后肢为9号，空白为10号。常用的染色剂有：

（1）3%～5%苦味酸溶液：涂染黄色。

（2）2%硝酸银溶液：涂染咖啡色，涂染后需光照10min。

（3）0.5%中性红或品红溶液：涂染红色。

（4）煤焦油酒精溶液：涂染黑色。

（5）甲紫溶液：涂染紫色。

2.耳孔法：用专门的打孔器直接在动物耳朵的不同部位上打孔或打缺口来表示一定号码的方法。打孔法应注意防止孔口愈合，多使用消毒滑石粉涂抹在打孔局部。

3.挂牌法：用金属制作的标牌固定在动物的颈部、耳部或腿部；或将分组编号写在卡片上，挂在动物饲养笼外。

4.烙印法：直接将号码烙印在动物无体毛或明显部位，如耳、面鼻部和四肢部位等。烙印前对烙印部位应预先用酒精消毒防感染，烙印后在烙印部位用棉球蘸上溶于酒精的黑墨或煤烟涂抹。

5.体内埋号法：在动物体内埋入带有编号的电子芯片，让每只动物均有唯一的身份证，一般用于长期慢性实验。

大鼠、小鼠一般用染色法、耳孔法进行标号，家兔及豚鼠多用烙印法和染色法，挂牌法和体内埋号法适用于各种实验动物的标记编号。

二、常用动物的捉持和给药

1.小鼠的捉持和给药方法

（1）抓持法　将小鼠放于粗糙面上（如鼠笼盖），用右手轻轻地后拉小鼠尾巴的中部或根部。当其向前爬行时，以左手的拇指和食指捏住小鼠两耳及头颈部皮肤，捏住的皮肤要适量，太多太紧小鼠会窒息。然后左手翻转，掌心向上，将鼠体置于左手大鱼际上，再用无名指、小指夹住其尾部，使小鼠腹部向上，身体呈一条直线。

（2）灌胃　左手捉持小鼠使头部朝上，右手持配有灌胃针头的注射器，自口角插入口腔，针头紧沿着上腭进入食管，如遇阻力，应将针头抽出再插，以免刺破食管或误入气管。灌胃液最多不超过1mL。

（3）皮下注射　注射部位常选背部皮下。以左手拇指和食指捏起两耳略靠后的背部皮肤，右手持注射器针头刺入皮下，若针头易于摆动、轻抽无回血则表明针尖已位于皮下，注入药液，旋转注射器出针，以防药液从针眼处漏出。

（4）肌内注射　以左手捉持小鼠并用小指夹住欲注射的后肢，右手持注射器（4～5号针头）将针头刺入后肢外侧部肌肉，尽量避开血管及坐骨神经。注射量每侧不超过0.2mL。

（5）腹腔注射　以左手捉持小鼠，使腹部朝上，头部略低，右手持注射器（5～5.5号针头）取45°角刺入腹腔，回抽无血、尿液或肠液即可注射。穿刺部位不宜太高，刺入不宜太深，以免伤及内脏。注射量不宜超过1mL。

（6）尾静脉注射　将小鼠置固定筒内，露出尾巴，涂擦75%乙醇，或将鼠尾浸入45～50℃温水中使血管扩张。用右手拉住尾尖，选择扩张最明显的血管，右手持注射器（4～4.5号）取15°角将针头刺入静脉推入药液。穿刺从尾部开始，以便失败后可在穿刺点上部重复进行。注射量为0.2～1mL。

2.大鼠的捉持和给药方法

将大白鼠放于粗糙面上，用右手拉其尾，左手五指抓住其颈背部皮肤即可。由于大鼠较凶猛，捉拿时要戴防护手套。大鼠的各种给药方法基本与小鼠相同。此外，大鼠尚可进行舌下静脉给药。

3.豚鼠的捉持和给药方法

（1）捉持法　一手拇指和中指从豚鼠背部伸到腋下，另一只手托住其臀部即可。体重轻者可一只手捉拿。

（2）皮下、腹腔、肌内注射　方法基本同小鼠，给药量分别为0.5～1.0mL/只、0.3～0.5mL/只、2～4mL/只。

（3）静脉注射　后脚掌外侧静脉注射时，可由一人捉持并固定豚鼠一条后腿，另一人先将注射部位去毛，用酒精棉球涂擦使血管扩张，然后用小儿头皮针针头刺入血管推注药物。

4.家兔的捉持和给药方法

（1）捉持法　右手抓住兔颈背部皮肤将其轻轻提起，再用左手托住其臀部，使兔呈坐位姿势，或将其置于固定箱内。

（2）灌胃　将兔置于固定箱内，使用开口器打开兔口，取8号导尿管从开口器中部小孔插入，沿上腭后壁轻轻送入食管，送入约15～20cm以达胃部。若误入气管动物会出现剧烈挣扎和呼吸困难，也可将导尿管的外端浸入水内，观察有无气泡出现，如无气泡可推入药液，随后再注入少许空气，以便将导尿管中的药液全部推至胃中，而后慢慢抽出导尿管。灌胃量10mL/kg体重。

（3）皮下、腹腔、肌内注射　给药方法基本同小鼠，只是针头可稍大，给药量增加（皮下0.5mL/kg体重、肌内1.0mL/kg体重，腹腔5mL/kg体重）。

（4）静脉注射　将兔固定于兔箱内，选用耳缘静脉，用酒精棉球涂擦皮肤或用手指轻弹该处，使静脉扩张显露易于辨认，用左手拇指和中指捏住耳尖部，食指垫在兔耳注射处的下面，右手持注射器（6号针头）取15°角刺入，前后稍滑动辨认针头是否在血管内，如在血管内即以手指将针头和兔耳固定，将药液推入，尽量从远心端开始。注射药液量可达2.0mL/kg体重。

5.青蛙、蟾蜍的捉持及给药方法

（1）捉持法　以左手持握，用食指和中指夹住一侧前肢，大拇指压住另一侧前肢，以右手协助将两后肢拉直，左手无名指和小指将其压住固定。

（2）淋巴囊注射　蛙的皮下有数个淋巴囊，一般多选腹部淋巴囊注射给药，将针头从蛙大腿上端刺入，经大腿肌层入腹壁肌层，再浅出进入腹壁皮下，即进入腹淋巴囊，然后注入药液。

6.猫的捉持及给药方法

（1）捉持法　方法同家兔，应注意利爪和牙齿伤人。也可采用套网或固定袋固定。

（2）灌胃、腹腔注射　基本同兔。

（3）皮下注射　多选大腿外侧或臀部，提起皮肤，将注射针头刺入皮肤与肌肉间，注入药液。

（4）肌内注射　常选臀部和股部肌内注射。

（5）静脉注射　常选前肢皮下静脉。固定猫前肢，用橡皮筋扎紧肘关节上部，使前肢静脉充血，去毛，75%酒精消毒，针头向近心端刺入静脉后，松开橡皮筋，注入药液。

此外，还可从后肢股静脉、颈静脉、舌下静脉注射给药。

7.犬的捉持及给药方法

（1）捉持法　可用特制嘴套将犬嘴套住，并将嘴套上的绳带拉至耳后颈部打结固定。也可用绳带绑嘴，方法为在犬嘴的上下部打结并绕到颈后再次打结固定。

（2）灌胃　将犬头部固定，取导尿管用水润湿后从口腔慢慢插入食管约20cm，用纱带绑住嘴。其余方法同家兔。

（3）皮下注射、肌内注射、静脉注射　方法同猫。

（4）腹腔注射　一人固定犬，将其头、颈部压在地上，另一人提起后肢将药液注入腹腔。

三、血液的采集

（1）心脏采血　兔、犬、大（小）鼠、豚鼠可选择心脏取血。动物仰卧固定，用剪刀剪去左侧胸部的被毛，用碘酒、酒精消毒皮肤，左手触摸心脏搏动处，兔、犬一般选择在胸骨左缘第3～4肋间心脏跳动最明显处穿刺，豚鼠一般选择在胸骨左缘第4～6肋间心脏跳动最明显处作穿刺点，左手拇指和食指在胸腔右侧加压以固定心脏位置，右手持注射器从心搏最强处垂直缓慢向下刺入。见到注射器内回血后，立即停止刺入，左手扶住针头避免晃动和刺入过深，右手缓慢抽拉针栓抽吸血液。大（小）鼠心脏穿刺采血时，麻醉，操作者右手持注射器，针头从剑突软骨与腹腔间凹陷处刺入，针尖穿过横膈膜继续刺入2.5～3.0cm，一旦感到针管有轻微搏动，表明针尖已进入心脏内，当针头准确刺到心脏时，血液随心跳而进入注射器。采到所需要的血量后，立即拔出注射器，去掉针头后将血推进准备好的试管/离心管内，干棉球按压针眼后将动物放回笼中。

心脏穿刺采血定位准确，一般不需要开胸，抽血快，血液不易凝集，采血量多是其最大特点。但应用本方法采血后，心脏损伤较大，难以迅速愈合，不利于短期连续采血。心脏采血时注意迅速并直接刺到心脏，缩短针留在心脏内的时间，防止血液在注射器内凝固。如果第一次没有刺准，应拔出针头重新操作，切忌针头在胸腔内左右摆动，以防损伤心脏和肺而死。采血时，要缓慢而稳定地抽吸，否则太多的真空反而使心脏塌陷。家兔、犬心脏采血时，采血者选择心搏最强处穿刺，可随针接触心跳的感觉，随时调整刺入方向和浓度，摆动的角度尽量小，避免损伤心肌过重，或造成胸腔大出血。豚鼠身体较小，心脏穿刺采血一般可不必将动物固定在解剖台上，可由助手握住前后肢进行心脏采血。鼠类心脏较小，心脏搏动快，采血时位置较难固定，操作难度大，需要麻醉，且容易因操作问题导致动物死亡，若做开胸一次死亡采血，先将动物做深麻醉，打开胸腔，暴露心脏，用针头刺入右心室，吸取血液。小鼠约0.5～0.6mL；大鼠约4～8mL。

（2）腹主动脉采血　动物麻醉，仰卧位固定，由下腹部向上作“V”形切口至两侧肋骨下缘，充分打开腹腔。用无齿镊子剥离结缔组织，做腹主动脉分离手术，血管分离后，选择腹主动脉分叉处向心端1～3mm处为穿刺点，左手持棉签轻轻压住腹主动脉分支上方，阻断血流。右手持注射器，将针头沿动脉向心方向刺入血管，左手缓慢抬起棉签，抽动针栓即可取血。采到所需要的血量后，立即拔出注射器，去掉针头后将血推进事先准备好的试管/离心管内，用动脉夹夹住止血2～3min。

腹主动脉采血法取血量大、不易溶血，适用于多项目检测，不损伤器官，不会出现因操作不当造成的气栓与淤血等。但操作比较复杂，技术性较强。取血动物需要完全麻醉，掌握适宜的麻醉深度，防止心跳骤停。

（3）断尾采血　大（小）鼠所需血量很少时可选择断尾采血的方法。将清醒动物装入鼠筒内固定，露出鼠尾。用75%酒精消毒尾巴，用温水（45～50℃）加温鼠尾，使鼠的尾静脉充分充血后擦干，用锐器（刀或剪刀）剪去尾尖（大鼠5～10mm，小鼠3～5mm），从尾根部向尖端按摩，血自尾尖流出，用试管接住。取完血后，采用压迫止血法进行止血。当所需血量很少时采用断尾采血。操作方便，每鼠一般可采血10余次以上。但每次采血量少，小鼠每次可取血0.1mL，大鼠0.3～0.5mL。采血时需使动物尾部血管充盈，一次割去鼠的尾尖不宜过长。采血结束，尾尖采血伤口暴露在外，易感染，应注意防止感染。

（4）眼球后动静脉丛采血　大（小）鼠采集等量的血液，又需避免动物死亡时可选择眼球后动静脉丛采血方法。采血时，将大鼠、小鼠放在鼠笼面边缘，左手拇指及食指从背部轻轻压迫动物的颈部两侧，食指轻轻向下压迫头部，使头部静脉血液回流困难，眼球充分外突。右手持定量采血毛细玻璃管（毛细管内径0.5～1.0mm），使采血器与鼠成45度的夹角，将其尖端插入眼睑和眼球内眦之间，沿内眦眼眶后壁向喉头方向旋转刺入，刺入深度小鼠约2～3mm，大鼠约4～5mm。当感到有阻力时即停止推进，同时，稍后退0.1～0.5mm，保持水平位，稍加吸引，血液自动进入取血管，在得到所需的血量后，放松手压力，同时抽出取血管。将取血管内的血滴入事先准备好的容器中，取血完毕，立刻用脱脂棉压迫止血。左右眼可交替采血，采血伤口较小，愈合较快，因此本法可在短期内重复采血。若手法恰当，体重20～25g的小鼠每次可采血0.2～0.3mL；体重200～300g大鼠每次可采血0.5～1.0mL。但眼球后动静脉丛采血不能避免组织液的混入，对于血样要求较高的研究应谨慎使用。为防止术后穿刺出血，采血后立即用消毒纱布压迫眼球30秒（s）。

（5）颌下动静脉丛采血　大（小）鼠可选择颌下动静脉丛采血。固定大（小）鼠，需手持动物肩胛骨之间的皮肤，确保其头部和前肢不能摆动，而不要抓住两只耳朵（会造成皮肤或者面部血管扭曲），大（小）鼠下颌动静脉丛位于下颌骨后方咬肌边缘，酒精棉球擦拭采血部位消毒，将灭菌注射针头迅速刺入，血液即流出。采血结束，立即用灭菌干棉球压迫止血。颌下动静脉丛采血可多次重复采集血液样本，每次采血量可控于0.2～0.5mL，不会给大（小）鼠造成大的伤害，采血后动物恢复快。采血时进针的力度和深度需要经过多次的实验和训练才能很好地把握，尽量避免刺伤下颌骨，采血过程要遵循无菌操作原则，一定要用酒精棉球擦拭采血部位，一方面是进行消毒，另一方面，由于血液由下颌部被毛处流出，有可能粘连上毛发污染血液。

四、血液的分离及保存

1.血液的分离

（1）血清分离　血清是血液离体后凝固析出的液体部分，除纤维蛋白原和相关凝血因子在血液凝固过程中被消耗和变性外，其他成分与血浆基本相同，适用于多数的血液化学和免疫学检验。标本离心前一般令其自行凝集，通常于室温（22～25℃）放置30～60min，血标本可自发完全凝集；加促凝剂时凝集加快，此时标本采集后应轻轻颠倒混合5～10次，以确保促凝剂作用。离心15～20min，离心力1000～1200g，可见上层无色和浅黄色透明上清液即为血清，吸取上清液，置洁净试管中备用，或放于-20℃冰箱保存。

（2）血浆分离　血浆为全血抗凝后经离心除去血细胞后的成分，通常将一定量抗凝剂加入采血管制成抗凝管，或在采出的血液中加入抗凝剂，使血液与抗凝剂迅速充分混合及时阻断血液凝固，但应避免剧烈振荡导致溶血。抗凝血离心10min，离心力1000～1200g，可见上层金黄色半透明的上清液即为血浆，下层暗红色的沉淀为红细胞，红细胞层上有一薄层灰色物质即白细胞和血小板，如三层分界不清楚，即有溶血现象。吸取上清液，置洁净试管中备用，或放于-20℃冰箱保存。

（3）白细胞分离　全血抗凝后，加入6%右旋糖酐（分子量200～400kD）或1%甲基纤维素生理盐水溶液混匀，然后将试管直立（室温或37℃）静止30～60min，待形成清晰红细胞界面时，用吸管将红细胞界面上的富含白细胞和血小板的血浆层移入另一试管中，离心，离心力300～600g，丢弃上层血浆，加入Hanks液（无钙镁）或PBS，300g离心5min，洗涤3次即可。

（4）红细胞分离　抗凝全血离心，离心力800～1000g，弃去上层血浆和白细胞层，用生理盐水稀释红细胞8倍（不少于8：1）轻轻混合洗涤、离心、吸弃上清液，共洗涤三次，以除去血浆蛋白和白细胞，最后一次尽量吸弃生理盐水，余下为压积红细胞，将压积红细胞配成所需浓度。

（5）去纤维血的制作　取全血，立即注入装有玻璃珠的灭菌瓶内，充分振摇脱出纤维，置冰箱内保存。

2.抗凝剂的选择及要求

（1）草酸盐　常用的草酸盐抗凝剂种类有草酸钠、草酸钾、草酸铵。其溶解度大，抗凝作用强，与血混合后迅速与血液中钙离子结合，形成不溶解的草酸钙，使血液不凝固。主要用于凝血象检验，但草酸盐对凝血因子Ⅴ的保护能力较差，影响凝血酶原时间测定。另外，草酸盐与钙结合形成的沉淀物会影响自动血凝分析仪的使用。高浓度草酸盐抗凝剂可发生溶血并改变血液pH，干扰血钾、钠和氯的测定，还能抑制一些酶的活性。不可用于测定钾、钙的抗凝剂和红细胞比容。

（2）枸橼酸盐枸橼酸盐能与血液中的钙离子结合形成螯合物，从而阻止血液凝固。常用的枸橼酸盐有枸橼酸三钠。适用于多项血液学检验和红细胞沉降率测定。不适用于凝血象检验和血小板功能试验。

（3）乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·H2O）或乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2·2H2O）EDTA，能与血液中钙离子结合成螯合物，使凝血过程中无钙离子参与，因而血液不能发生凝固。特别适用于全血细胞分析，尤其适用于血小板计数。由于其影响血小板聚集及凝血因子检测，故不适合做凝血试验和血小板功能检查。

（4）肝素　肝素具有抗凝活性强、不影响血细胞体积、不易溶血等优点。可以保持红细胞的自然形态，是红细胞渗透脆性理想的抗凝剂。肝素抗凝剂不适合用于凝血功能的检验、白细胞计数和分类计数。

3.血液标本的保存

当血液标本不能立即测定时，根据不同的检验内容，决定血液标本的存放时间和存放温度，不适当的保存环境可直接影响检验结果。

（1）冷藏保存：血浆在4℃保存24h后，某些凝血因子活性减少95%。供血细胞分析仪进行细胞计数的EDTA抗凝全血应保存于室温，但不宜超过6h。如果在4℃保存可使血小板计数结果降低。

（2）冷冻保存：要长时间保存血液中有活性的成分如凝血因子、酶类等，可采取分离血清或血浆后快速深低温冷冻的方式，但脂蛋白电泳、载脂蛋白A1及载脂蛋白B100测定所用的血清或血浆不能深低温冷冻。冷冻的标本应避免反复冻融。

五、常用实验动物的麻醉处死方法

当实验中途停止或结束时，实验者应站在实验动物的立场上以人道的原则去处置动物，原则上不给实验动物任何恐怖和痛苦，也就是要施行安乐死。安乐死是指实验动物在没有痛苦感觉的情况下死去。实验动物常用处死方法包括：

1.颈椎脱位法　常用于小鼠和大鼠处死。左手拇指与食指用力向下按住鼠头，以右手抓住鼠尾用力向后上方牵拉，使颈椎脱臼，脊髓与脑髓拉断，立即死亡。

2.空气栓塞法　主要用于大动物的处死，用注射器将空气急速注入静脉，可使动物致死。当空气注入静脉后，可在右心随着心脏的跳动使空气与血液相混致血液呈泡沫状，随血液循环到全身。如进入肺动脉，可阻塞其分支，进入心脏冠状动脉，造成冠状动脉阻塞，发生严重的血液循环障碍，动物很快致死。一般兔与猫可注入10～20mL空气。狗可注入70～150mL空气。

3.放血法　此法应用于大鼠和小鼠等小动物时，常剪断动物的股动脉，放血致死。如果是犬、猫或兔等稍大型动物应先使动物麻醉、暴露股三角区或腹腔，再切断股动脉或腹主动脉，迅速放血。动物在3～5min内即可死亡。

4.断头法　此法适用于鼠类等小动物，可用直剪刀，也可用断头器。断头法处死动物时间短，并且脏器含血量少，若需采集新鲜脏器标本可采用此法。

5.断髓法　此法适用于蟾蜍、蛙类等小动物。蟾蜍、蛙类可直接捣毁脊髓，将金属探针插入枕骨大孔，破坏脑脊髓使动物死亡，操作过程中要防止毒腺分泌物射入实验者眼内。

6.药物致死法

（1）药物吸入　药物吸入致动物死亡适用于啮齿类，如小鼠、大鼠、豚鼠等小动物，操作简单，是实验中安乐死的常用方法。因CO2无毒，制备方便，效果确切，是最常用的致死药物。可以采用特制的安乐死箱，能使CO2气体充满整个箱室，确保麻醉致死效果和人员安全。

（2）药物注射　通过将药物注射到动物体内，使动物致死。这种方法适用于较大的动物，如兔、猫、犬等。氯化钾适用于家兔和犬，可采用静脉注射的方式。高浓度的钾可使心肌失去收缩能力，心脏急性扩张，致心脏迟缓性停跳而死亡。巴比妥类麻醉剂适用于兔、豚鼠，用药量为深麻醉剂量的25倍左右。一般用量为90mg/kg，约15min内死亡。