第三节　沼气发酵微生物代谢

一、沼气发酵过程中的水解酶酶活变化规律

1901年Söhngen指出产甲烷过程是一个微生物的过程，1967年O.W.Lawrence和P.L.McCarty提出了厌氧消化过程的阶段理论，即水解、产氢产乙酸和产甲烷三个过程。沼气发酵是一个多菌群在厌氧条件下共生代谢、使有机物矿化为甲烷和二氧化碳的过程。从甲烷消化的三阶段理论看，水解过程是甲烷消化过程的开始，同时也是产甲烷的限速步骤。在沼气发酵过程中胞外水解酶（hydrolases）有蛋白酶（protease）、纤维素酶（cellulase）、脂肪酶（lipase）和淀粉酶（amylase）等，这些水解酶在发酵过程中是变化的，并且它们的酶活较高时，有利于发酵原料的降解利用，提高原料的产气率。

（一）沼气发酵残留物水解酶的酶活结果

要使沼气发酵得以进行，首先基质中的蛋白质、脂肪、纤维素和淀粉等要能被降解，而这一过程需要各种水解酶的参与才能完成。实际分析的结果表明，沼气发酵残留物中确实存在这些酶类（表1-12），并具有一定的活性。

（二）沼气发酵过程中的水解酶酶活变化规律

以农村沼气发酵广泛使用的猪粪、牛粪和鸡粪为原料，采用批量发酵装置，进行了一个产气周期的实验，在发酵过程中对蛋白酶、纤维素酶、液化型淀粉酶、糖化型淀粉酶以及脂肪酶等水解酶的酶活力以及产气量进行测定，考察各种水解酶的酶活与沼气产量之间的关系。

1.猪粪发酵

以猪粪为原料的实验结果表明，蛋白酶的酶活变化与沼气发酵的三阶段理论是相吻合的，开始为水解产酸阶段，此时酸性蛋白酶开始起作用，随着沼气发酵的进行，中性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶活开始升高。在猪粪的沼气发酵过程中，碱性蛋白酶和纤维素酶的酶活峰值与沼气产气量的峰值是相关的（图1-14和表1-13）。液化型淀粉酶的酶活在猪粪的沼气发酵过程中一直呈下降趋势，脂肪酶和糖化型淀粉酶的酶活则随产气量的变化而变化（图1-15和表1-14）。

①a-P——酸性蛋白酶，μg酪氨酸/（mL·min）。

②n-P——中性蛋白酶，μg酪氨酸/（mL·min）。

③b-P——碱性蛋白酶，μg酪氨酸/（mL·min）。

④C——纤维素酶，μg葡萄糖/（mL·min）。

①L——脂肪酶，μg脂肪酸/（mL·min）。

②α-A——液化型淀粉酶，mg淀粉/（mL·h）。

③γ-A——糖化型淀粉酶，mg葡萄糖/（mL·h）。

2.牛粪发酵

以牛粪为原料的实验结果表明，酸性蛋白酶和中性蛋白酶与沼气产气量之间的关系不明显，脂肪酶的酶活在发酵前期增高，随发酵进行而减弱；碱性蛋白酶、纤维素酶、液化型淀粉酶和糖化型淀粉酶与沼气产气量有密切的关系，且这几种水解酶的酶活峰值正好处在沼气产气量的峰值期间（图1-16和表1-15）。

①产气量单位为mL/周。

②产气率单位为mL/（mL·d）。

③a-P——酸性蛋白酶，μg酪氨酸/（mL·min）。

④n-P——中性蛋白酶，μg酪氨酸/（mL·min）。

⑤b-P——碱性蛋白酶，μg酪氨酸/（mL·min）。

⑥C——纤维素酶，μg葡萄糖/（mL·min）。

⑦L——脂肪酶，μg脂肪酸/（mL·min）。

⑧α-A——液化型淀粉酶，mg淀粉/（mL·min）。

⑨γ-A——糖化型淀粉酶，mg葡萄糖/（mL·h）。

3.鸡粪发酵

以鸡粪为原料的实验结果表明，中性蛋白酶、碱性蛋白酶和脂肪酶与沼气产量之间的关系不明显，酸性蛋白酶的酶活在发酵前期表现为上升，但很快就表现为下降趋势；纤维素酶、液化型淀粉酶和糖化型淀粉酶与沼气产量之间的关系较为密切，且这三种水解酶的酶活高峰均出现在沼气产气的高峰附近（图1-17和表1-16）。

①产气量单位为mL/周。

②产气率单位为mL/（mL·d）。

③a-P——酸性蛋白酶，μg酪氨酸/（mL·min）。

④n-P——中性蛋白酶，μg酪氨酸/（mL·min）。

⑤b-P——碱性蛋白酶，μg酪氨酸/（mL·min）。

⑥C——纤维素酶，μg葡萄糖/（mL·min）。

⑦L——脂肪酶，μg脂肪酸/（mL·min）。

⑧α-A——液化型淀粉酶，mg淀粉/（mL·min）。

⑨γ-A——糖化型淀粉酶，mg葡萄糖/（mL·h）。

通过对猪粪、鸡粪和牛粪三种原料的沼气发酵过程的水解酶活分析表明，蛋白酶的变化表现为，开始酸性蛋白酶活性较强，随后减弱，而中性蛋白酶活性开始增强，其后减弱，而碱性蛋白酶活性增强，这与沼气发酵的三阶段理论基本相符。纤维素酶的酶活性较低，但与产气之间的关系较为密切，在产气量的峰值附近，活性力为2μg葡萄糖/（mL·min）以上，具体是猪粪原料时为0.81～3.5μg葡萄糖/（mL·min），酶活的峰值出现于发酵的第3周，滞后于产气的峰值；鸡粪原料的纤维素酶为2.5～7.3μg葡萄糖/（mL·min），这一峰值出现在发酵的第3周，与猪粪的结果相似，但不同的是鸡粪发酵的产气峰值出现较晚；牛粪原料的纤维素酶为2.1～2.9μg葡萄糖/（mL·min），这一峰值出现在发酵的第3～4周，与产气量的峰值相一致。脂肪酶的变化与产气量的变化较为一致，但在猪粪发酵中的脂肪酶酶活明显高于牛粪和鸡粪。液化型淀粉酶（即α-淀粉酶）在猪粪发酵过程中一直呈下降趋势，而在鸡粪和牛粪的发酵过程中与产气量是相关的。糖化型淀粉酶（即糖化酶，或γ-淀粉酶）在猪粪、鸡粪和牛粪的发酵过程中与产气量是密切相关的，但在猪粪的发酵中酶活力较高。沼气发酵过程中与产气量相关的各种水解酶活力值详见表1-17。

水解酶的酶活力在沼气发酵过程中的变化规律研究结果可得出如下结论：

①水解酶活性与发酵原料的利用有关，酶活增强有利于原料的水解利用。

②各种水解酶活力的峰值均出现在产气量的峰值附近，其活性与沼气产气量相关。

③蛋白酶活力与沼气发酵产气量之间的关系不明显。

④纤维素酶、脂肪酶和糖化酶的酶活性与产气量之间的关系较为密切。

（三）沼气发酵添加水解酶的效果

加入液化型淀粉酶后，猪粪常温发酵32d的详细结果见表1-18。加入糖化型淀粉酶后，猪粪常温发酵40d的详细结果见表1-19。加入纤维素酶后，猪粪常温发酵40d的详细结果见表1-20。加入蛋白酶后，猪粪常温发酵40d的详细结果见表1-21。

以上分别单独使用4种水解酶的沼气发酵实验结果表明，液化型淀粉酶、糖化型淀粉酶和纤维素酶能有效提高沼气发酵的产气量，蛋白酶对沼气发酵则表现出一定的抑制作用。事实上，在沼气发酵中，各种水解酶是共同作用的。因而，采用1000mL实验型水压式厌氧消化装置进行猪粪半连续发酵实验150d，添加混合酶系能显著提高沼气的产量（16.23％）（表1-22）。采用混合酶系添加于猪粪沼气发酵池中（4m3商品化玻璃钢沼气池）能提高原料的TS产气率，猪粪的TS产气率达0.377m3/kgTS，在同一地区比不加混合酶系的猪粪沼气发酵（TS产气率一般为0.30m3/kgTS）提高25.67％。

二、产氢产乙酸菌的代谢

产氢产乙酸菌（the obligate H2-producing acetogenic bacteria）是不产甲烷微生物中一群极为重要的细菌种类。产氢产乙酸菌在沼气发酵中，利用丙酮酸、富马酸、甲酸、有机酸和脂肪等为原料，代谢产生氢和乙酸。

有机酸和醇必须由产氢产乙酸菌将其分解转化为乙酸后，才能为产甲烷菌利用和代谢。我们先看如下反应：

丙酸CH3CH2COOH+2H2OCH3COOH+CO2+3H2+76.1kJ

丁酸CH3CH2CH2COOH+2H2O2CH3COOH+2H2+48.1kJ

乙醇CH3CH2OH+H2OCH3COOH+2H2+9.6kJ

乳酸CH3CHOHCOOH+H2OCH3COOH+CO2+2H2+9.6kJ

上述所有反应，若在标准状况下，不但不能产生能量，反应过程反而需要能量，因而这些反应是不可能发生的。要实现上述反应，只有降低体系中的氢分压，即利用产甲烷菌消耗体系中的氢。换句话说，产氢产乙酸菌和产甲烷菌共同代谢，方能实现上述反应。这种不同生理类群间的产氢和用氢的相互关系叫做种间氢转移（interspecies H2-transfer），两种菌的这种相互关系则称为互营联合，这一作用是厌氧消化的核心。

1967年，Bryant和Wolin首次研究证明奥氏产甲烷菌（Methanobacterium omelianskii）实际上是主甲烷杆菌和“S”有机体（即利用乙醇产氢的细菌）的互营联合共生体，这一研究结果为产甲烷菌和非产甲烷菌之间关系的研究奠定了基础，导致了对甲烷发酵本质的认识。1973年，Iannotti等首先用一个恒化器联合培养白色瘤胃球菌（Ruminoccus albus）和琥珀酸弧菌（Vibrio suceinogenes）来发酵葡萄糖。R.albus单独生长时产生乙酸盐、乙醇、H2；当与V.suceinogenes联合培养，加入R.albus不能代谢的反丁烯二酸盐，反丁烯二酸盐被V.suceinogenes还原成琥珀酸盐，在这样的联合培养条件下，R.albus的终产物完全变为乙酸盐和二氧化碳，无游离H2产生。很显然，当与V.suceinogenes共同培养时，它利用的H2将反丁烯二酸盐还原成琥珀酸，同时由于H2的消耗，R.albus发酵糖不再形成乙醇，反而产生相应数量的乙酸和二氧化碳。鉴于偶联这两种细菌的中间物质是分子氢，Iannotti把这种偶联作用称为“种间氢转移”（interspecies H2transfer）。

（一）种间氢转移

挥发性有机酸的甲烷发酵过程往往涉及不产甲烷菌和产甲烷菌的共生代谢，从反应热力学角度分析，总反应的自由能大都大于零，即反应不能发生，但在沼气发酵过程中确实发生了反应。这类反应之所以能够进行，是因为产甲烷细菌与非产甲烷菌之间存在互营联合作用，即种间氢转移（interspecies H2-transfer）。在沼气发酵中，产氢菌源源不断地提供H2，而产甲烷细菌则连续不断地消耗H2，这就可以保证不致因为H2的积累而抑制产氢菌的代谢，同时也使沼气发酵得以正常进行。

1967年，Bryant利用改良的Hungate厌氧技术分离纯化了奥氏产甲烷菌（Methanobacterium omelianskii）菌株，得到产甲烷杆菌MOH菌株和“S”有机体（S strain），并证实这两种菌之间对乙醇的代谢具有良好的互营联合作用（图1-18）。1979年，为了纪念Bryant的卓越工作，Balch等把产甲烷杆菌MOH菌株定名为布氏甲烷杆菌（Methanobacterium bryantii）。

1977年，Thauer等进一步研究了乙醇氧化的各步自由能变化：

C2H5+NAD+→CH3CHO+NADH+H+　ΔG=+23.8kJ　　　　　（1-15）

NAD+为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

NADH+H+→NAD++H2　ΔG=+18kJ　　　　　（1-16）

CH3CHO+H2O→CH3COO-+H2+H+　ΔG=-32.2kJ　　　　　（1-17）

总反应：

C2H5OH+H2O→CH3COO-+2H2+H+　ΔG=+9.6kJ　　　　　（1-18）

即当H2的分压为1atm时，反应不能发生。若把反应中的氢分压降至10-4atm，则总反应的自由能就变为-35.9kJ，反应就能 顺利进行。

在种间氢转移的关系中，有一类化能异养菌绝对地依赖种间氢转移进行其代谢活动，丙酸盐、丁酸盐的氧化就是由这类化能异养菌进行的。从图1-19中不难看出，只有当氢分压分别小于10-6atm和10-4atm时，从丙酸盐和丁酸盐产氢的自由能变化才为负值；而当氢分压小于10-8atm时，不利于氢和二氧化碳产生甲烷的反应。因此，由脂肪酸顺利产甲烷的氢分压必定在10-8～10-6atm之间。对产氢产乙酸菌的研究，必须把其和用氢的产甲烷菌共同培养，在此条件下方能进行研究，鉴于技术上的困难，有关的研究报道不多。Bryant实验室报道了两个分别代谢丙酸盐和丁酸盐的共培养物。其中的产氢产乙酸菌分别为沃林互营杆菌（Syntrophobacter wolinii）和沃尔夫互营单胞菌（Syntrophomonas wolfei）。

1987年，刘聿太分离得到Syntrophomonas wolfei，1989年，钱泽澍、马晓航研究了这一互营联合作用。有关产氢产乙酸菌与产甲烷菌的种间氢转移反应见表1-23。

产氢产乙酸菌是不产甲烷微生物中一群极为重要的细菌种类。产氢产乙酸菌在沼气发酵中，利用丁酸、丙酸和乙醇等有机底物为原料，代谢产生氢和乙酸，才能为产甲烷菌利用和代谢，形成了两类不同生理菌群间的互营联合作用，见表1-23。

从表1-23可以看出，在有机酸和乙醇产氢产乙酸的代谢过程中，在标准生理状况下，不但不能产生能量，反而还需要能量，因而这些反应是不可能发生的。要实现上述反应，只有利用产甲烷菌消耗体系中的氢，降低体系中的氢分压，在产氢产乙酸菌和产甲烷菌共同代谢下，方能实现。这种不同生理类群间的产氢和用氢的相互关系叫做种间氢转移（interspecies hydrogen transfer），两种菌的这种相互关系则称为互营联合，这一作用是厌氧消化的核心。在沼气发酵中，产氢菌源源不断地提供H2，而产甲烷细菌则连续不断地消耗H2，这就可以保证不致因为H2的积累而抑制产氢菌的代谢，同时也使沼气发酵得以正常进行。

（二）氢分压对种间氢转移的影响

在产氢产乙酸菌与产甲烷菌的互营联合体系中，较低的H2分压有利于乙醇、丙酸和丁酸的氧化，而对产甲烷作用则不太有利，因此，H2分压必须维持在一定的水平上，使乙醇、丙酸和丁酸的氧化细菌和产甲烷细菌都能够从中获得能量，维持正常的代谢。理论上适宜的H2分压，我们可以根据表1-23的反应进行推导。

在推导过程中，下列公式中未包括H2O和H+，因在25℃、正常生理条件下，它们的浓度分别为55mol/L和10-7mol/L，且已包含在内。以kJ为单位，H2分压以大气压（atm）为单位，温度以K为单位，则理想气体常数R=8.314×10-3，得出ΔG'与H2分压的关系：

产甲烷作用

丁酸氧化作用

ΔG'=+62.0+22.8lg[H2]　　　　　（1-20）

丙酸氧化作用

ΔG'=+236.2+68.4lg[H2]　　　　　（1-21）

乙醇氧化作用

ΔG'=+19.3+22.8lg[H2]　　　　　（1-22）

由式（1-19）～式（1-22）得到ΔG'与H2分压的关系图1-20。

在ΔG'与H2分压的对数图中，产甲烷作用与H2分压的对数关系是一条斜率为-22.8kJ/反应的直线，ΔG'=0时，H2分压为5.3×10-6atm。该直线表明，随着H2分压的增大，ΔG'越负，释放出的能量越多，有利于产甲烷菌的代谢，而乙醇、丙酸和丁酸的氧化作用却刚好相反。乙醇和丁酸的氧化作用是两条斜率为+22.8kJ/反应的平行线，表明它们受H2分压的影响是一致的，只不过是ΔG'=0时的H2分压分别为1.4×10-1atm和1.9×10-3atm，而丙酸氧化作用的斜率为+68.4kJ/反应，受H2分压的影响比乙醇和丁酸的氧化作用要大得多。此外，图1-20也表明，在有机酸氧化和产甲烷过程中，种间氢顺利转移，体系中必须维持一定的H2分压，由式（1-19）～式（1-22）可得到表1-24中ΔG'≤0时的H2分压及理论H2分压范围。

从表1-24可知，乙醇氧化作用的理论H2分压范围较宽，相比之下，丙酸和丁酸氧化作用的范围显得较窄，尤其是丙酸的更为明显，因此丙酸被认为很容易干扰厌氧生物反应器就显得合情合理。

然而上述计算仅只是ΔG'≤0时的理论H2分压范围，并没有考虑到细胞能够利用的最小能量，我们先看细胞内的ATP合成

ADP+Pi→ATP+H2O

在标准状态下，每合成1molATP耗能约为32kJ，但在标准生理状态下，每合成1molATP耗能则增至49kJ左右，此外，在ATP的合成中还有能量损耗，平均为20kJ/mol，这样，在生物细胞中，合成1molATP的总能耗约为70kJ。根据Mitchell化学渗透假说，ATP的形成伴随带电基团（质子）的跨膜运输，现已公认，形成或水解1个ATP都伴有三个质子透过质膜，这意味着ATP已不再是细胞可以利用的最小能量单位，真正的最小能量单位（能量子）应当是ATP当量的1/3，大约20～25kJ/mol。也就是说，只要代谢基质能够释放20～25kJ/mol的能量，就能为细胞所利用。据此，在计算适宜的理论H2分压范围时，取ΔG'≤-25kJ，得出表1-25。

通过以上计算分析，H2分压是维持产氢产乙酸菌与产甲烷菌正常代谢、种间氢转移顺利的关键因素。在互营体系中，乙醇型、丙酸型和丁酸型的适宜H2分压范围分别为6.7×10-5～1.1×10-2atm、6.7×10-5～1.5×10-4atm和6.7×10-5～1.5×10-4atm。对于H2分压的下限，与Cord和Ruwisch等1988年测定的享氏甲烷螺菌（Methanospirillum hungatei）产甲烷的H2分压临界值3.0×10-5atm和史氏甲烷短杆菌（methanobrvibacter smithii）的9.8×10-5atm基本相符。Seitz等（1990年）在含有乙醇氧化菌乙炔暗杆菌（Pelobacter acetylenicus）的互营共培物的能量分步研究中发现的ΔG'≥-16kJ/mol，即H2分压约大于10-2atm时，则乙醇不能被氧化，这一数值与乙醇氧化作用的H2分压的上限大致相符。

（三）种间氢转移过程中H2分压调节下的能量分配

为了满足产氢产乙酸菌和产甲烷菌互营体系的代谢平衡，获得各自所需的足够的能量，H2分压调节起着重要的作用。我们先以丁酸氧化和产甲烷互营体系为例，来看在适宜的H2分压范围内，H2分压调节对满足各自所需的能量所起的作用。

根据式（1-19）和式（1-20），在H2分压为1.5×10-4atm时，丁酸氧化时沃氏共养单胞菌（S.Wolfei）获得25.0kJ的能量，而产甲烷菌获得33.0kJ的能量，这时产甲烷菌获得足够多的能量，其生长代谢速度势必快于丁酸氧化菌，消耗大量的H2，引起H2分压下降。相反，在H2分压为6.7×10-5atm时，丁酸氧化菌获得33.0kJ的能量，而产甲烷菌获得25.0kJ的能量，这时丁酸氧化菌生长代谢速度较快，产氢过剩，H2分压上升。这样，在H2分压6.7×10-5～1.5×10-4atm间，存在着满足丁酸氧化菌和产甲烷菌互营体系能量代谢平衡的最佳H2分压，令式（1-19）=式（1-20），即

ΔG'=-120.2-22.8lg[H2]=+62.0+22.8lg[H2]

得出最佳H2分压为1.01×10-4atm，在此H2分压下，丁酸氧化菌和产甲烷菌在丁酸氧化和产甲烷过程中，均获得29.1kJ的能量。并且大于细胞可以利用的最小能量单位20.0～25.0kJ。

同理可得出丙酸氧化菌（S.Wolinii）、乙醇氧化菌（S.organism）和产甲烷菌互营体系能量代谢平衡的最佳H2分压，参见表1-26。

从表1-26可知，丁酸氧化-产甲烷互营体系的最佳H2分压为1.01×10-4atm，丙酸氧化-产甲烷体系的最佳H2分压为1.24×10-4atm，乙醇氧化-产甲烷体系的最佳H2分压为8.73×10-4atm。在厌氧消化器内，为了使丁酸、丙酸、乙醇得到充分氧化，从理论上讲，H2分压应保持在1.01×10-4～8.73×10-4atm范围内，这一数值和正常厌氧消化器内的实测值10-5～10-4atm相符。另外，从代谢平衡能量的值，我们也可以知道，乙醇最容易被氧化，丙酸和丁酸相差不大，从而导致在厌氧消化器内乙醇的检出限较低。

总之，氢分压的调节平衡，在厌氧消化过程中，是各类菌群间互相协调、共同进化的结果。一旦平衡被破坏，一段时间后，又回到平衡状态，它们始终有一种保持趋于平衡的趋势。

三、耗氢产乙酸菌及其它不产甲烷微生物的代谢

（一）耗氢产乙酸菌

耗氢产乙酸菌又称同型产乙酸菌（homoacetogen），这是一类混合营养型细菌，它们既能代谢氢和二氧化碳生成乙酸，也能代谢糖类产生乙酸。有人估计，由这些菌形成的乙酸，在一个40℃的牛粪消化器中，只占总乙酸的1％～2％，在60℃占3％～4％。其相关反应如下：

2CO2+4H2→CH3COOH+2H2O

C6H12O6→3CH3COOH

氢和二氧化碳的水解不如甲烷菌的生长快。已分离到的耗氢产乙酸菌分属4个属10多种，如：

Acetobacterium woodii　　　　伍德产乙酸杆菌

Acetobacterium wieringae　　　　威林格产乙酸杆菌

Acetogenium livi　　　　基维产乙酸菌

Acetoanaerobium noterae　　　　诺特拉乙酸厌氧菌

Clostridium thermoautotro phicum　　　　嗜热自养梭菌

Clostridium formicoaceticum　　　　甲酸乙酸梭菌

Clostridium aceticum　　　　乙酸梭菌

Sporomua acidovorans　　　　嗜酸芽孢菌

Sporomua shpacroides　　　　拟球型芽孢菌

耗氢产乙酸菌广泛分布于自然界，且种类繁多，这类微生物可把有机物转化为乙酸。据估计全球每年由二氧化碳固定产生的有机物约有1.5×1011t，其中10％的生物质经厌氧消化转化为二氧化碳和甲烷。在甲烷的代谢中，有72％的甲烷来源于乙酸。尽管如此大量的乙酸形成并非仅仅是耗氢产乙酸菌所为，但这类菌在自然界中乙酸的形成以及碳循环中起着重要的作用。

某些耗氢产乙酸菌能参与苯甲基醚的厌氧降解，这种苯甲基醚是木质素降解的中间产物，以前认为木质素的降解仅仅是在好氧条件下进行的。现已证实，苯甲基醚可由这类菌发酵生成乙酸和酚，酚进一步降解为乙酸，乙酸再被产甲烷菌利用后降解为甲烷和二氧化碳。这一过程可以由伍德产乙酸杆菌（Acetobacterium woodii）、嗜酸嗜没食子酸暗杆菌（Pelobacter acidigallici）和巴氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina barkeri）的互营共培养物所完成，这表明木质素可以在厌氧条件下被最终降解为甲烷和二氧化碳。

（二）产氢细菌

不产甲烷微生物中产氢细菌是一群极为重要的种类。产氢细菌在沼气发酵中，利用丙酮酸、富马酸、甲酸、有机酸和脂肪等为原料，代谢产生氢。

国外许多学者已从阴沟污泥和其它许多地方分离出了大量的厌氧和兼性厌氧产氢细菌，其中厌氧产氢细菌最多，分属4个类型共计31种；兼性厌氧产氢细菌仅有1个类型，共计11种（表1-27）。1979年，中国科学院成都生物研究所从薯芋淀粉沼气发酵污泥中分离出了24株产氢细菌，它们分属6个类型（表1-28）。

（三）其它特殊细菌

其它特殊细菌如去硫弧菌（Desul phovidrio），是一种严格的厌氧菌，能还原硫酸盐。链球菌（Streptococcus sp.）、拟杆菌（Bacteroides sp.）、梭状芽孢杆菌（Clostridium sp.）等，能利用乳酸代谢产生乙酸和丙酸。

四、产甲烷菌

（一）产甲烷菌的分类地位

沼气的主要成分是甲烷，甲烷则是由产甲烷菌（methanogens）产生的，因而产甲烷菌是沼气微生物的核心。研究产甲烷菌不仅对研究沼气的产生和发酵机理是必需的，而且对研究和揭示生命的起源有着重大的意义。

产甲烷菌有4种形态，即杆菌、球菌、螺旋菌和八叠球菌（参见图1-21和图1-22）。

注：八叠球菌（Methanosarcina）（左上）、甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）（右上）、甲烷螺菌（Methanos pirillum）（左下）和甲烷杆菌（Methanobacterium）（右下）；这些细胞分别放大了2500倍、5000倍、1000倍和5000倍。

20世纪70年代末80年代初，一些微生物学家（主要是研究产甲烷菌的微生物学家）如弗克斯（Fox）、沃尔夫（Wolfe）、巴尔奇（Balch）、伍斯（Woese）等，通过对几百种微生物的16SrRNA的比较，依据某些细菌的核酸结构、细胞壁成分以及细胞膜脂质组成等方面的研究结果，提出了生命三领域学说。Woese等认为，从种系的发生上看，古细菌（Archaebacteria）既不属于真核生物，也不属于真细菌，古细菌与真核生物或与真细菌之间的亲缘关系同真核生物与真细菌之间的亲缘关系一样甚远（按SAB值比较结果），因此古细菌系生命的第三种特征。1990年，Woese进一步提出将古细菌achaebacteria，这个带有bacteria后缀、易混淆的名称更换为archaea，与真核（eucarya）、原核（eubacteria）相对。Archaea由三类生物群组成：产甲烷菌、极端嗜热嗜酸细菌和极端嗜盐菌（图1-23）。产甲烷菌是研究得最多、种属亦最多的古菌。

1956年，H.A.Barker将产甲烷菌依据其独特的产甲烷功能归并为一个科，按其不同的形态特征将其分为杆菌和球菌两类即属，再依据生理性状和对基质的利用进行种的分类，即1科，4属，8种。

A杆状：可呈链状、柳叶刀状球形菌

属1：甲烷杆菌属（Methanobacterium）3个种

B杆状：可形成孢子

属2：甲烷芽孢杆菌属（Methanobacillus）1个种

C球菌：形成于孢囊之中

属3：甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）2个种

D球菌：单生或成对、成堆簇状

属4：甲烷球菌属（Methanococcus）2个种

1974年出版的第八版伯捷氏细菌鉴定手册（Bergy’s Manual of Determinative Bacteriology）中将产甲烷菌列为1个甲烷细菌科（Methanobacteriaceae），下分3个属，共9种。

1979年W.E.Balch和R.S.Wolfe依据16SrRNA寡核苷酸碱基序列的不同源性大小（SAB值），确定了它们在分类地位上的相似性，从而提出了一个比较完整的分类系统，并将产甲烷菌分为3目，4科，7属，14种。

1989年，在伯捷氏细菌鉴定手册新版第三卷，产甲烷菌已列有3目，6科，13属，43种。

1993年，Boone根据新的一些发现和研究结果，修改了产甲烷菌的分类，把甲烷八叠球菌科上升为一个目，即甲烷八叠球菌目；依据Burggraf等发现的一个产甲烷菌新菌，建立了火热产甲烷菌目。因此，最新的产甲烷菌分类表为5目，10科，25属，59种（表1-29）。

2001年出版的Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology第1卷第二版，将产甲烷菌放在宽广古生菌门（Euryarchaeota）中，分为3纲（产甲烷杆菌纲Methanobacteria、产甲烷球菌纲Metha-nococcii、火热产甲烷菌纲Methanopyri），5目，10科，26属，但种方面，与Boone1993年的分类表相比，除有增加外，种的归属也有一些调整，如Methanococcus jannaschii改为Methanocaldococcus jannaschii等，总计有产甲烷菌78种。

（二）产甲烷菌的代谢基质

沼气的主要成分是甲烷，甲烷则是由产甲烷细菌产生的，因而产甲烷细菌是沼气微生物的核心。产甲烷细菌只能代谢少数几种简单的底物生成甲烷，它们是H2、CO2、甲酸、甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙酸等。近年发现个别产甲烷菌株可以代谢乙醇、丙酸、异丙酸、异丁酸生成甲烷。在消化器中，约有三分之二的甲烷是由乙酸裂解形成的，而余下的大部分则来自CO2的还原。1980年，Wolfe用纯培养的方法研究了产甲烷菌的代谢，他发现几乎所有的产甲烷菌都能利用氢和二氧化碳代谢产生甲烷。产甲烷菌对基质代谢的有关化学反应如下：

氢（hydrogen）还原二氧化碳：4H2+2CO2CH4+2H2O

甲酸（formic acid）：4HCOOHCH4+3CO2+2H2O

甲醇（methanol）：4CH3OH3CH4+CO2+2H2O

乙酸（acetic acid）：CH3COOHCH4+CO2

甲胺（methylamine）：4CH3NH2+2H2O3CH4+4NH3+CO2

二甲胺（dimethylamine）：2（CH3）2NH+2H2O3CH4+2NH3+CO2

三甲胺（trimethylamine）：4（CH3）3N+6H2O9CH4+4NH3+3CO2

（三）甲烷形成的理论

1.二氧化碳还原理论

20世纪30年代初，Van Niel（1930年和1934年）提出了甲烷形成理论，即二氧化碳还原形成甲烷的理论，它认为在所有情况下，可形成甲烷的有机化合物首先氧化成二氧化碳，然后二氧化碳还原形成甲烷，这就是二氧化碳形成甲烷的理论。该理论可用下式进行描述：

式中，H2A代表可能被沼气微生物所利用的有机化合物，二氧化碳则是由基质氧化而产生的。

通过用乙醇、丁酸盐和一氧化碳转化为甲烷的研究证实了这一理论。相关的研究表明，已知的产甲烷菌纯培养，都能利用氢还原二氧化碳产生甲烷。

脂肪酸形成甲烷和二氧化碳的一般过程用反应可表示为：

当n为偶数时，发酵进行得最好。

1939年，布什韦尔（A.M.Buswell）和哈特菲尔德（Hatfield）提出了有机物转化为甲烷和二氧化碳的计算公式：

当n>时，水参与甲烷形成的反应。

2.甲基还原理论

1948年，A.M.Buswell和索洛（Sollo）提出了甲烷形成的还原理论，即：

3.巴克假说

根据二氧化碳还原理论和甲基还原理论，乙酸在形成甲烷时，其甲基部分可直接还原形成甲烷，羧基部分可形成二氧化碳后，进一步还原生成甲烷：

巴克综合了这两种理论，提出了甲烷的可能途径的一种假设，如图1-24所示。

图中XH是未知载体，后来证实，CoM是一种载体。这一假设认为，无论是二氧化碳、甲醇，还是乙酸盐，在厌氧条件下都能形成CH3X，CH3X进一步被还原形成甲烷，只是它们所走的途径不同而已。

（四）乙酸盐和甲酸盐代谢生成甲烷的机制

1956年，Barker第利用巴氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina barkeri）为材料，成功地研究了乙酸盐的甲烷裂解机制：

14CH3COOH→14CH4+CO2

几乎全部甲基转化为甲烷，全部羧基转化为二氧化碳。

1978年Smith和Mah，1979年Zinder和Mah对甲烷八叠球菌（Methanosarcina sp.）的研究，以及1980年Zehnder等和1982年Huser等对甲烷丝菌（Methanothrix sp.）的研究也都证实了Barker的结果。

1980年wolfe提出，CoM可能参与乙酸盐转化生成甲烷的最后反应。

很多产甲烷菌都可以利用甲酸生长产生甲烷，其转化途径是通过甲酸产氢酶产生氢和二氧化碳，然后再生成甲烷。1983年Ferguson and Mah通过加入放射性二氧化碳，在产物甲烷中检测到放射性碳，从而证明了甲酸甲烷代谢的历程，其历程如下：

4HCOOH→4H2+4CO2

4H2+CO2→CH4+2H2O

总反应：　4HCOOH→CH4+3CO2+2H2O

（五）甲烷的来源

几乎所有的产甲烷菌均能利用氢还原二氧化碳代谢产生甲烷，而大部分产甲烷菌则能利用乙酸盐代谢产生甲烷，甲烷杆菌和甲烷八叠球菌能利用一氧化碳还原生成甲烷，一些氢营养型产甲烷菌能利用代谢乙醇生成甲烷，甲烷八叠球菌能利用甲醇和甲胺代谢产生甲烷，一些甲基型产甲烷菌能利用甲基硫化物代谢产生甲烷。在厌氧消化过程中，甲烷的产生有72％来源于乙酸盐的代谢，28％则来源于氢还原二氧化碳（图1-25）。

五、不产甲烷微生物与产甲烷菌之间的关系

沼气发酵过程中参与代谢的微生物种类相当复杂，每一种微生物通过自身的生命活动，完成有机物分解的一定过程，并最终为产生甲烷起着各不相同的作用。因此，有机物代谢过程的复杂性和厌氧的特定环境，使厌氧发酵微生物形成一定的微生物群体。哈伯逊（Hobson）和肖（Shaw）研究了猪粪自发厌氧发酵时各种微生物的变化。

第一周：细菌总数5×106～5×107个/mL，淀粉分解菌大于4×104个/mL。

第三周：产甲烷细菌开始出现，数量约为103个/mL，并且随发酵的进行逐渐增加。

第四周至第五周：纤维素分解菌的数量为104～105个/mL，蛋白质分解菌出现，其数量大于4×104个/mL。

第九周：甲烷菌数量达106个/mL。

从以上我们可以看出，产甲烷细菌随发酵过程的进行而不断增加，各类微生物的数量亦在不断地变化着。在沼气发酵过程中，所有微生物的关系既相互协同又相互制约，共同维持着发酵过程的平衡。不产甲烷细菌与产甲烷菌间的关系体现在如下几个方面。

①不产甲烷细菌为产甲烷菌提供生长基质和产甲烷所需的底物。不产甲烷菌把各种复杂的有机物如碳水化合物、蛋白质、脂类等进行厌氧降解，生成氢、二氧化碳、氨、乙酸、甲酸、丙酸、丁酸、乙醇等产物，其中，丙酸、丁酸、乙醇等又被一类产氢产乙酸菌分解转化为氢、二氧化碳、乙酸等。这样，不产甲烷菌通过其生命活动为产甲烷菌提供了合成细胞物质和产甲烷菌所需的碳源、电子供体、氢供体和氮源，产甲烷菌利用这些物质进行生命活动和产生甲烷。

②不产甲烷细菌为产甲烷菌创造适宜的氧化还原条件——厌氧环境。在沼气发酵初期，由于加料使空气进入沼气发酵池，原料、水本身也携带有空气，这显然对产甲烷菌是有害的。它的去除，就必需依赖于不产甲烷菌类群中那些需氧或兼性厌氧微生物的代谢活动。各种厌氧微生物对氧化还原电位的适应性也不相同，通过它们有顺序性的交替生长和代谢活动，使发酵料液氧化还原电位不断下降，逐步为产甲烷菌创造了适宜的氧化还原电位条件。

③不产甲烷细菌为产甲烷菌清除有毒物质。在以工业废水或废弃物为发酵原料时，其中可能含有酚类、苯甲酸、氰化物、长链脂肪酸、重金属等对产甲烷菌有毒害作用的物质。不产甲烷菌中有许多种类能够降解苯环并从中获得能量和碳源，有些则能以氰化物作为碳源，有较多的微生物能降解长链脂肪酸生成乙酸和较短脂肪酸。这些作用，不仅消除了对产甲烷菌的毒害，而且提供了产甲烷菌的基质。此外，不产甲烷菌的产物硫化氢可以与重金属离子作用，生成不溶性的金属硫化物沉淀，从而解除了一些重金属离子的毒害作用，如：

④产甲烷菌为不产甲烷细菌生化反应解除反馈抑制。不产甲烷菌的发酵产物可以抑制其本身的不断形成。如氢的积累可以抑制产氢产酸菌继续产氢，酸的积累可以抑制产氢产酸菌继续产酸。再如，将丙酸加入到丙酸杆菌（Propionilacterium shermanil）的连续培养中，会降低丙酸的产生和丙酸杆菌的生长速率。虽然乙酸的产量对发酵影响不大，但加入高浓度的乙酸，则会使乙酸产生菌受到抑制。人们研究发现，在厌氧消化系统中，乙酸的浓度最大限制值为3000mg/L，一旦超过这个值，就会使沼气发酵池酸化，厌氧消化就不能很好地进行下去。在正常的沼气发酵中，产甲烷菌连续不断地利用由不产甲烷菌代谢产生的氢、乙酸和二氧化碳等基质，使得沼气发酵过程不至于有过多的氢和酸积累，从而也就不会由于氢和酸的积累而产生反馈抑制。

⑤不产甲烷细菌与产甲烷菌共同维持沼气发酵环境中的适宜pH值。在沼气发酵的初期，不产甲烷菌首先降解原料的碳水化合物、脂肪和蛋白质等，产生大量的有机酸，产生的二氧化碳也部分溶于水，使发酵料液的pH值明显下降。而此时，一方面不产甲烷菌类群中的氨化细菌迅速进行氨化，产生NH3中和部分酸；另一方面，产甲烷菌利用乙酸、氢和二氧化碳形成甲烷，消耗了酸和二氧化碳，从而维持沼气发酵适合的pH值范围。

⑥不产甲烷细菌构建了产甲烷菌的“古环境”，这或许正是产甲烷菌进化滞缓的缘由。产甲烷菌具有简单性和古老性（表1-30），而其细胞的胞壁、脂质和基因等，均表现出不完整性和原始性。产甲烷菌能生存繁殖，必定会有其特定的类似于原始“古环境”的环境。在厌氧消化系统中，一方面，不产甲烷菌在代谢过程中对气体物质作用，建造了“类古气体环境”；另一方面，这些不产甲烷菌又提供了产甲烷菌正常代谢的物质基础。这或许正是几十亿年来产甲烷菌能保持古菌特征的基础。